Bakteriofagi: Znaczenie bakteriofagów dla mleczarstwa

Bakteriofagi, atakujące komórki bakterii fermentacji mlekowej, są jedną z przyczyn zaburzeń procesów fermentacyjnych prowadzonych w przemyśle mleczarskim w celu otrzymywania mlecznych produktów fermentowanych, tj. jogurty czy sery. Szacuje się, że 60-70% zakłóceń technologicznych w produkcji twardych serów podpuszczkowych jest powodowane infekcjami bakteriofagów szczepów bakterii mlekowych z rodzaju Lactococcus. Infekcje bakteriofagami mezofilnych kultur startowych w krajowych zakładach mleczarskich wywołują poważne problemy biotechnologiczne. Zakażenie bakteriofagami prowadzi nie tylko do zakłócenia procesu produkcji (obniżenia produkcji kwasu mlekowego przez bakterie mlekowe, co powoduje: niewystarczające obniżenie wartości pH, większą zawartość laktozy w produkcie, wysoki potencjał redoks, opóźnienie procesu fermentacji), czy nawet do zahamowania fermentacji mleka, ale przede wszystkim, i co najważniejsze, do strat finansowych, na co zakłady mleczarskie nie powinny sobie pozwalać.

Z tej przyczyny istotne jest przestrzeganie pewnych zasad higieniczno-sanitarnych oraz technologicznych zapobiegających dostaniu się bakteriofagów na teren zakładu i ich rozprzestrzenianiu się na jego terenie. Można byłoby oczekiwać, że przy obecnym stanie wiedzy o bakteriofagach, znajomości sposobów zabezpieczania się przed infekcją nimi, metod ich zwalczania, zakres zaburzeń procesów fermentacyjnych w przemyśle mleczarskim powinien być na jak najniższym poziomie. Nic bardziej mylnego! Niestety, w tym przypadku spotykamy się z prostą ludzką regułą postępowania: czego oczy nie widzą, tego nie ma. Taki stereotyp zachowania prowadzi do nieprawidłowości technologicznych skutkujących niepowtarzalną lub bardzo niską jakością wyrobów (zmiana konsystencji, obniżenie właściwości organoleptycznych produktów, brak hydrolizy laktozy, brak wydzielenia serwatki i zmniejszenie wydajności skrzepu serowarskiego) lub, w najłagodniejszej wersji, kłopotami w procesie przetwórczym. Dlatego tak ważne jest zachowanie zasad GMP (dobrej praktyki przemysłowej) oraz GHP (dobrej praktyki higienicznej). Dla przypomnienia, w przemyśle mleczarskim spotyka się najczęściej bakteriofagi bakterii fermentacji mlekowej. Są to wirusy infekujące wyłącznie komórki bakteryjne bakterii fermentacji mlekowej. Należą do wirusów dsDNA, czyli zawierających dwuniciowy DNA. Są to wirusy o izometrycznej lub wydłużonej główce, posiadające ogonek. Klasyfikuje się je do trzech rodzin: Siphoviridae, Myoviridae oraz Podoviridae. Zgodnie z klasyfikacją Bradleya, bakteriofagi bakterii fermentacji mlekowej należą do trzech morfotypów: A (kurczliwy ogon), B (długi, niekurczliwy ogon) i C (krótki niekurczliwy ogon). Warto zauważyć, że ogony i głowy są to podstawowe elementy strukturalne cząsteczek bakteriofagów. Ich wielkość i budowa są podstawą klasyfikowania morfotypów wszystkich znanych ludzkości bakteriofagów.

Jeśli chodzi o bakteriofagi bakterii fermentacji mlekowej, to pierwsze bakteriofagi bakterii z rodzaju Lactococcus wyizolowano w 1935 roku. Od tego czasu w wielu laboratoriach na całym świecie są prowadzone badania nad bakteriofagami, jak również metodami ich zwalczania. Wiadomo że bakteriofagi bakterii fermentacji mlekowej wykazują zróżnicowane działanie na komórki bakteryjne. Na tej podstawie wyróżnia się dwa typy infekcji bakteriofagami: lityczne i lizogeniczne. Generalnie, infekcja komórki bakteryjnej bakteriofagiem przebiega w następujących etapach:

1. adsorpcja (przyczepienie) cząstki bakteriofaga do powierzchni komórki bakteryjnej (do tego bakteriofagi wykorzystują receptory obecne na powierzchni komórki),
2. injekcja fagowego materiału genetycznego (wirusowego DNA) do wnętrza komórki bakteryjnej za pomocą białek wirusowych,
3. cyrkularyzacja genomu bakteriofaga,
4. ekspresja wczesnych genów bakteriofaga (z wykorzystaniem naturalnych mechanizmów komórki bakteryjnej) i przejęcie kontroli nad metabolizmem komórki bakteryjnej,
5. replikacja genomu bakteriofaga i degradacja genomu komórki bakteryjnej (jedno z pierwszych syntetyzowanych białek wirusowych służy do zniszczenia DNA bakterii),
6. ekspresja późnych genów bakteriofaga i produkcja białek strukturalnych bakteriofaga,
7. dojrzewanie nowych cząstek bakteriofaga (składanie kapsydu, czyli główki cząstki wirusa, zbudowanej z jednego lub więcej rodzajów białek, i pakowanie genomowego DNA bakteriofaga, w postaci wirionu, do kapsydów),
8. liza komórki bakteryjnej i uwolnienie potomnych cząstek bakteriofaga.

Ponieważ w trakcie ataku komórki bakteryjnej przez bakteriofaga metabolizm zainfekowanej komórki zostaje podporządkowany informacji genetycznej wirusa, to zmienia się aktywność komórki bakteryjnej, która zostaje przestawiona na powstawanie potomnych cząstek wirusa. W efekcie, w komórkach bakterii fermentacji mlekowej obserwuje się zahamowanie lub wręcz zatrzymanie procesów fermentacyjnych, finalnie następuje liza oraz śmierć komórki bakteryjnej, zaś nowo powstałe cząstki wirusa infekują kolejne komórki bakteryjne znajdujące się w środowisku i cykl namnażania bakteriofagów zaczyna się od początku. Infekcja przebiegająca w ten sposób nosi nazwę litycznej. Objawy takiej infekcji można zauważyć bardzo szybko, bowiem już przy pierwszym ataku bakteriofagów litycznych stwierdza się zakłócenia w tempie namnażania się komórek bakteryjnych, a w rezultacie, w aktywności biochemicznej tych bakterii, czyli szybkości procesu fermentacji. Niektóre bakteriofagi nie powodują natychmiastowego rozpadu komórki bakteryjnej, ale uwalniane są stopniowo. W ich przypadku mówi się o infekcji lizogenicznej. Pierwsze etapy infekcji tego rodzaju przebiegają podobnie jak w infekcji litycznej – następuje wnikanie materiału genetycznego bakteriofaga do komórki bakteryjnej i dochodzi do replikacji jego DNA, która jednak nie kończy się lizą komórki bakteryjnej. DNA bakteriofaga integruje się do genomu komórki bakteryjnej, a taka jego postać jest określana mianem profaga. Niektóre komórki bakterii utrzymują w swoim chromosomie nawet więcej niż jednego profaga, co nazywa się multilizogenią. Z każdym powielaniem się komórki bakteryjnej, również materiał genetyczny bakteriofaga ulega replikacji i jest przekazywany do potomnych komórek bakterii. Ponieważ infekcja lizogeniczna nie skutkuje szybką śmiercią komórek bakteryjnych, stwierdzenie faktu takiej infekcji jest trudne do zaobserwowania. Można nawet powiedzieć, że stan lizogenii uodparnia komórki bakteryjne na możliwość zainfekowania przez bakteriofagi blisko spokrewnione z profagiem. Jednak, w pewnych sytuacjach (na przykład w warunkach stresowych) profag może zostać wydzielony z genomu komórki bakteryjnej i wejść w cykl lityczny, prowadząc do szybkiej śmierci komórki bakteryjnej. I dopiero zauważenie takiego zakłócenia cyklu technologicznego, fermentacji lub namnażania biomasy komórek bakteryjnych, może sugerować, że zaszła infekcja bakteriofagiem.

Bakteriofagi, które po zainfekowaniu komórki bakteryjnej powodują szybką lizę, określa się mianem bakteriofagów wirulentnych (zjadliwych). Takie bakteriofagi stwierdza się u bakterii mlekowych z rodzajów Lactococcus i Lactobacillus (w tym gatunków Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus, Lb. acidophilus, Lb. casei, Lb. rhamnosus, Lb. helveticus, Lb. delbrueckii subsp. lactis, Lb. gasseri), wykorzystywanych w technologii mleczarskiej do otrzymywania m.in. serów podpuszczkowych oraz mlecznych napojów fermentowanych. Nie są obecnie znane bakteriofagi lityczne bakterii z gatunku Pediococcus acidilactici, chociaż były opisywane dla halofilnych bakterii z rodzaju Pediococcus stosowanych w produkcji fermentowanych sosów sojowych. Jak dotąd nie określono również stopnia zjadliwości bakteriofagów bakterii z rodzaju Leuconostoc. Bakteriofagi, które nie prowadzą do szybkiej śmierci komórek bakterii fermentacji mlekowej, określa się mianem bakteriofagów łagodnych (utemperowanych). Firmy biotechnologiczne oferujące kultury starterowe dla przemysłu mleczarskiego nauczyły się wykorzystywać „łagodność” niektórych bakteriofagów do zwiększania oporności komórek bakteryjnych wobec częściej występujących bakteriofagów bakterii fermentacji mlekowej. Sposobem na wykorzystanie utemperowanej zjadliwości bakteriofagów lizogennych jest przygotowanie takich bakteryjnych kultur startowych, w których zachodzi monitorowana infekcja bakterii mlekowych przez lizogennego bakteriofaga, a następnie indukowana i kontrolowana w czasie autoliza komórek bakteryjnych i tym samym uwolnienie wewnątrzkomórkowych enzymów, m.in. proteolitycznych i lipolitycznych. Takie kultury startowe znajdują zastosowanie w serowarstwie do skrócenia fazy dojrzewania serów podpuszczkowych, podczas której dodatkowe porcje aktywnych enzymów są pożądane, a wręcz konieczne, do osiągnięcia właściwych przemian składników skrzepu mlecznego, a szczególnie kazeiny. Główną rolę w tym procesie odgrywają enzymy syntetyzowane przez komórki kultur starterowych. W przypadku serów podpuszczkowych twardych, dojrzewanie trwa od trzech miesięcy do roku i wymaga zapewnienia kontrolowanych klimatycznych warunków chłodniczych, co jest bardzo kosztowne. Z tego powodu firmy biotechnologiczne podejmują próby skrócenia tego procesu, poprzez wprowadzenie do komórek bakterii mlekowych niezbędnych enzymów, lub konstruowanie takich kultur startowych, które charakteryzują się zwiększoną ekspresją genów kodujących określone białka, np. enzymów proteolitycznych i/lub lipolitycznych, albo kształtujących smak serów (np. peptydazy). Dla przykładu, lizogenne szczepy z gatunku Lactococcus lactis świadomie stosuje się w celu uzyskania szczepów autolitycznych, u których zachodzi ekspresja genu lizyny bakteriofaga. Jego produkt jest silnym czynnikiem litycznym komórek bakteryjnych, specyficznym wobec komórek bakterii mlekowych stosowanych w produkcji serów podpuszczkowych dojrzewających. Czynnik ten może służyć jako inhibitor wzrostu komórek bakteryjnych i wytwarzania kwasu mlekowego, powodując w ten sposób pożądany, wczesny rozpad komórek oraz uwolnienie enzymów wewnątrzkomórkowych istotnych w procesie dojrzewania serów.

W aplikacjach technologicznych innych niż produkcja serów dojrzewających, lizogenność jest bardzo rzadko wykorzystywana, a czasami wręcz niepożądana (np. w przypadku mlecznych napojów fermentowanych istotne jest, aby komórki bakterii mlekowych pozostawały żywe i aktywne jak najdłużej, gdyż tym determinują termin przydatności wyrobu do spożycia). Lizogenność jest rzadkim zjawiskiem u bakterii mlekowych z gatunku Streptococcus thermophilus i tylko 1-10% szczepów z gatunku Str. thermophilus, izolowanych z różnych środowisk, jest lizogennych. Trzeba podkreślić, że lizogenna kultura startowa, która może być oporna na dalsze infekcje tym samym typem bakteriofagów, sama w sobie stanowi pewne niebezpieczeństwo, gdyż może być źródłem infekcyjnego faga dla otoczenia produkcyjnego, w tym mikroflory towarzyszącej. Co ciekawsze, efekt uwalniania bakteriofagów przez lizogenne kultury startowe może być prawdopodobnie obserwowany nawet w mlecznych napojach fermentowanych, a jego objawem może być wymieranie poszczególnych szczepów w kulturach mieszanych (jak podaje piśmiennictwo, taki efekt obserwowano w przypadku szczepów z gatunku Lactobacillus acidophilus). Nielizynogenne kultury bakterii z gatunku Lactobacillus acidophilus, będące producentem bakteriocyny, mogą niestety być wrażliwe na ataki bakteriofagów.

To dlatego, przy wykorzystywaniu szczepów lizogennych bakterii mlekowych w serowarskich kulturach startowych, należy szczególną uwagę zwracać na higienę produkcji. Wydostanie się komórek szczepów lizogennych do otoczenia produkcyjnego (pomieszczeń zakładu) może doprowadzić do uwolnienia cząstek bakteriofaga, skażenia nimi pozostałej produkcji mleczarskiej (w tym mlecznych napojów fermentowanych lub kultur startowych stosowanych do ich produkcji) i spowodowania zakłócenia cyklu technologicznego. Wprawdzie firmy biotechnologiczne pracują nad mechanizmami zabezpieczenia przed niekontrolowanym uwolnieniem lizogennego bakteriofaga z lizogennych kultur starterowych do środowiska produkcyjnego, niemniej w interesie zakładu mleczarskiego jest utrzymywanie jak najwyższych standardów sanitarnych w przypadku stosowania tego typu starterów. Ponieważ bakteriofagi są jednym z istotnych czynników zakłócających fermentację mlekową i produkcję fermentowanych przetworów mleczarskich, w warunkach przemysłowych praktykuje się liczne techniki uniemożliwiające infekcję komórek bakterii mlekowych przez bakteriofagi. Podstawowe procedury polegają na zachowaniu czystości sprzętu i urządzeń oraz stałej kontroli procesu technologicznego. Brak higieny procesu produkcyjnego (nieprawidłowe lub niewystarczające mycie i dezynfekcja), źle utrzymana czystość pomieszczeń, zaniedbania higieniczne pracowników, nieprzywiązywanie wagi do dezynfekcji drobnego sprzętu produkcyjnego i laboratoryjnego, umożliwiają rozprzestrzenianie się bakteriofagów. Rozprzestrzenianiu się cząstek bakteriofagów sprzyjają również: niekontrolowane przemieszczanie się pracowników lub mas powietrza między strefami czystą i brudną zakładu, skropliny pary wodnej i opary, drobny sprzęt laboratoryjny, a nawet zły stan techniczny i sanitarny systemów wentylacyjnych. Zapobieganie infekcjom przez bakteriofagi może być realizowane różnymi metodami, które powinny być stosowane równolegle. Podstawą są skuteczne chemiczne lub fizyczne metody dezynfekcji powierzchni, maszyn i urządzeń produkcyjnych, mikrobiologiczne oczyszczanie powietrza w pomieszczeniach i stosowanie nadciśnienia oczyszczonego powietrza w pomieszczeniach, jak również ograniczenie wilgotności powietrza oraz ograniczenie przemieszczania się personelu i przestrzeganie wysokiej higieny pracowników. Warto zwrócić uwagę na fakt, że w przypadku bakteriofagów skuteczniejsza jest dezynfekcja chemiczna. Rozprzestrzenianiu się cząstek bakteriofagów sprzyja także unikanie krzyżowania dróg przesyłania mleka świeżego, mleka pasteryzowanego i serwatki (krajowe badania dowodzą, że co trzecia próbka serwatki zawiera bakteriofagi aktywne przeciwko szczepom z gatunku Lactococcus lactis, a wysokie miano tych fagów sugeruje, że liza indukowana przez nie jest główną przyczyną zakłócenia procesu fermentacji w serowarstwie), usuwanie stref zastoju (wody, serwatki, piany), eliminowanie stosowania pozostałości produktów ubocznych (serwatki, maślanki, odzyskanego białka, śmietanki serwatkowej) do kolejnego procesu fermentacyjnego, a jeżeli takie rozwiązanie jest praktykowane to wcześniej produkty te powinny być poddane obróbce termicznej (co najmniej w temperaturze 90°C). Inną z metod zapobiegania infekcjom przez bakteriofagi jest stosowanie wyselekcjonowanych starterów bakterii fermentacji mlekowej opornych na bakteriofagi, a także stosowanie starterów wieloszczepowych i wielogatunkowych przeznaczonych do bezpośredniego zaszczepiania mleka przerobowego i ich rotacja co kilka-kilkanaście dni. Powinno to iść w parze ze stosowaniem systemów zamkniętych zbiorników i wanien serowarskich (najlepiej z lekkim nadciśnieniem wewnątrz i filtrami zapobiegającymi przedostawaniu się bakteriofagów z powietrza do wnętrza). W przypadku konieczności prowadzenia zakwasów, etapy ożywania, namnażania i przeszczepiania starterów powinny odbywać się w warunkach aseptycznych, najlepiej z wykorzystaniem preparowanych bezwapniowych podłoży (tzw. podłożach antyfagowych).

Okazuje się, że lizyny bakteriofagowe można także stosować w bioochronie produktu i konsumenta (por. Ziarno M., Zaręba D. 2017. Bakteriofagi przeciwko patogenom w żywności. Forum Mleczarskie Biznes, 2, 23-25) w celu eliminowania bakterii niepożądanych (psujących produkt) lub nawet chorobotwórczych. Obserwuje się efekt zabójczego działania lizogennych kultur startowych bakterii z rodzaju Lactococcus, wchodzących w skład starterów mleczarskich przeciwko gronkowcom i bakteriom z rodzaju Listeria.

Nie należy zapominać, że nie tylko lizogenne kultury startowe mogą być źródłem bakteriofagów w zakładzie mleczarskim. Bakteriofagi bakterii fermentacji mlekowej występują powszechnie w środowisku naturalnym i są trudne do wyeliminowania. Potencjalnym ich źródłem może być sam surowiec i jego mikroflora. Z tego powodu ważne są warunki pozyskiwania mleka surowego i jego transportu z gospodarstwa do przetwórcy, a także warunki jego przechowywania. W tym przypadku także należy dbać o czystość sprzętu i urządzeń stosowanych do pozyskiwania i przechowywania mleka, utrzymanie w czystości cystern do transportu mleka oraz sprzętu do jego odbioru.