Laboratorium: Skrócić czas analiz
Metody instrumentalne
Metody instrumentalne pozwalają na wykonanie bezpośrednich znakowań oraz wykrycie w badanym materiale każdej nawet pojedynczej komórki bakteryjnej, drożdży czy pleśni. Tak istotne zminimalizowanie okresu oczekiwania na wynik, w porównaniu do tradycyjnych metod mikrobiologicznych, znacznie skraca czas i koszty magazynowania produktu u producenta. Metody instrumentalne są metodami zautomatyzowanymi pozwalającymi na szybkie uzyskanie, nawet już w ciągu 24 godzin, wyników testów jałowości handlowej, czy na bezpośrednią analizę jakościową lub ilościową w ciągu kilku minut. Ich dodatkową zaletą jest ograniczenie pracy manualnej pracowników laboratorium. Do takich metod instrumentalnych zalicza się metody bezpośredniego lub pośredniego wykrywania mikroorganizmów w próbkach żywności.
Metody instrumentalne bezpośrednie
Metody bezpośrednie polegają na wykryciu obecności lub określeniu liczby komórek mikroorganizmów zawartych w badanej próbce. Od dawna była znana i stosowana taka metoda bezpośrednia, ale wykonywana manualnie z użyciem mikroskopu optycznego. Była ona bardzo czasochłonna, pracochłonna i powodowała duże zmęczenie pracowników laboratorium. Obecnie dzięki rozwojowi technik, w tym technik optycznych i komputerowych, dysponujemy automatycznymi systemami bezpośredniego wykrywania i liczenia komórek mikroorganizmów w analizowanych próbkach. Zwykle czas takiego badania nie przekracza 15 minut.
Jedną z metod instrumentalnych jest bezpośrednia epifluorescencja (DEFT, z ang. direct epifluoresent filter technique), za pomocą której jesteśmy w stanie określić liczbę mikroorganizmów, zarówno żywych jak i martwych. Jest ona od szeregu lat stosowana do mikrobiologicznego badania mleka surowego (BactoScan firmy Foss). Wykorzystuje się w niej automatyczne liczenie komórek za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego, przy czym wstępnie komórki są barwione oranżem akrydynowym (ten fluorescencyjny barwnik ma silne powinowactwo do jąder komórkowych mikroorganizmów, żywe komórki fluoryzują pomarańczowo do czerwonego, martwe – zielono). Z kolei bezpośrednie barwienie komórek z wykorzystaniem chlorku 2-p-jodofenylo-5-fenylo-tetrazolu (INT) pozwala na barwienie przyżyciowe komórek mikroorganizmów. Taka technologia umożliwia znakowanie wszystkich żywych mikroorganizmów. Nawet tych, które rosną w warunkach stresu, w środowiskach o obniżonej zawartości składników wzrostowych czy obecnych inhibitorów wzrostu.
Coraz częściej tego typu techniki są oparte na metodzie cytometrii przepływowej. Tempo analiz (nawet do 50 prób na godzinę) oraz powtarzalność wyników uzyskanych z użyciem cytometrii przepływowej sprawiają, że cytometria przepływowa jest przydatna zarówno na etapie badania jakości surowców, w toku produkcji, jak i gotowego produktu (np. Chemunex D-Count firmy bioMérieux, BactoCount IBCm firmy Bentley). Cytometria przepływowa polega na zeskanowaniu cienkiego strumienia wstępnie przygotowanej próbki za pomocą cienkiej wiązki spolaryzowanego światła wzbudzającego, np. z lasera. Wstępne przygotowanie próbki polega m.in. na zabarwieniu obecnych w niej komórek mikroorganizmów specjalnymi barwnikami. Oświetlone komórki rozpraszają, załamują, odbijają lub absorbują światło, powodując zmiany sygnału elektrycznego, co jest rejestrowane przez fotokomórki. Zmiany sygnału elektrycznego zależą od barwy, struktury i intensywności zabarwienia komórki. Jednocześnie mierzone są wielkość i intensywność zabarwienia oraz intensywność fluorescencji komórek.
Obecnie obserwowany jest nie tylko intensywny rozwój zaawansowanych technik bezpośredniego liczenia komórek mikroorganizmów, ale także metod diagnostyki mikrobiologicznej które pozwalają na znaczne skrócenie czasu niezbędnego do zidentyfikowania mikroorganizmów. W ostatnich latach do szybkiej i poprawnej diagnostyki mikroorganizmów opracowano metody wykorzystujące spektrometrię masową. Systemy do szybkiej identyfikacji mikroorganizmów oparte o spektrometrie mas, pozwalają na otrzymanie wyniku już w kilka minut. Co pozwala identyfikować drobnoustroje w niezwykle prosty i wydajny sposób Rozwijane są także techniki szybkiej identyfikacji mikroorganizmów oparte na reakcjach immunoenzymatycznych (ELISA). Nadal nowością są biochipy (chipy DNA, sondy DNA), będące jednym z najnowszych osiągnięć technologii molekularnych, wykorzystujących wiedzę z zakresu genetyki, technik PCR, biochemii, analizy matematycznej, informatyki i statystyki. Są to systemy oferujące możliwość analizy żywności pod kątem czynników patogennych (mikroorganizmów, wirusów, pasożytów), jak również alergenów i produktów GMO. Technologia mikromacierzy DNA jest oparta na zjawisku selektywnego łączenia się badanych genów do sondy umieszczonej na płytce mikromacierzy. Metoda jest bardzo specyficzna, gdyż obecność mikroorganizmów oznaczana jest na podstawie ich cech genotypowych, co decyduje o dużej wybiórczości testu. W zależności od długości i pochodzenia cząstek umieszczonych na płytce, wyróżnia się dwa rodzaje mikromacierzy: mikromacierze cDNA oraz mikromacierze oligonukleotydowe.