Osteopontyna mleka krowiego w unijnym wykazie nowej żywności

Mleko jest zoptymalizowanym ewolucyjnie źródłem składników odżywczych niezbędnych dla potomstwa ssaków. Z tego względu zawiera wiele bioaktywnych substancji, w tym lipidy, węglowodany i białka stymulujące procesy budulcowe, kognitywne i odpornościowe. Wiele z tych związków to substancje białkowe, które w bezpośrednim działaniu lub uwalniane w procesie katabolicznym wykazują różne biofunkcje, m.in. przeciwdrobnoustrojowe, immunomodulacyjne, regulujące ciśnienie krwi i wiążące składniki mineralne. Do przykładowych bioaktywnych białek należą: laktoferyna, alfa-laktoalbumina, beta-laktoglobulina, haptokoryna, lizozym, białka otoczki kuleczek tłuszczowych (MFGM, Milk Fat Globule Membrane) oraz osteopontyna i wiele innych. W ostatnich latach duże zainteresowanie zyskała ostepontyna (OPN), którą wyizolowano pierwotnie z komórek nabłonkowych, następnie z mleka ludzkiego oraz bydlęcego i innych gatunków ssaków. 

Zgodnie z Rozporządzeniem wykonawczym Komisji (UE) 2023/463 w dniu 3 marca 2023 r. wydano zezwolenie na wprowadzenie na rynek osteopontyny („bmOPN”) z mleka krowiego jako nowej żywności. Nową żywnością nazywa się żywność, która do tej pory nie była spożywana w ilościach, które pozwoliłyby uznać ją za bezpieczną. Jest to żywność pozyskiwana najczęściej na drodze nowych technologii ze źródeł roślinnych, zwierzęcych, mikrobiologicznych i mineralnych, które nie były do tej pory używane jako żywność. Na tej podstawie dokonano zmian w Rozporządzeniu wykonawczym Komisji (UE) 2017/2470, ustanawiając unijny wykaz nowej żywności. Do dnia 26 marca 2028 r. osteopontyna (Lacprodan OPN-10) może być wprowadzana na rynek w Unii Europejskiej wyłącznie przez przedsiębiorstwo Arla Foods Ingredients Group, chyba że nowy wnioskodawca zgodnie z zasadami ochrony opisanymi w art. 26 Rozporządzenia (UE) 2015/2283 uzyska zezwolenie na przedmiotową nową żywność. Pierwszy wnioskodawca złożył do Komisji wniosek 27 marca 2020 r. Przedstawił kompletny panel badań mutagenności, genotoksyczności, toksyczność podprzewlekłą dziewięćdziesięciodniową i teratogenną. Dodatkowo na podstawie badań klinicznych na niemowlętach EFSA uznała bezpieczeństwo stosowania osteopontyny z mleka krowiego w początkowym żywieniu dzieci. Osteopontyna z mleka krowiego została dopuszczona do napojów na bazie mleka dedykowanych małym dzieciom, preparatów do dalszego żywienia niemowląt oraz początkowego żywienia niemowląt zgodnie z definicją z Rozporządzenia (UE) nr 609/2013. Maksymalna dawka w tych kategoriach żywności została ustalona na poziomie 151 mg/l w produkcie gotowym do spożycia, gotowym do obrotu lub przygotowanym do spożycia zgodnie z instrukcją producenta. Proponowana dawka jest 10-krotnie wyższa od naturalnej zawartości tego składnika w mleku krowim. Wykorzystanie osteopontyny w żywności wymaga etykietowania z użyciem zwrotu „osteopontyna z mleka krowiego”. Zgodnie ze specyfikacją osteopontyna z mleka krowiego jest izolowana z pasteryzowanej lub mikrofiltrowanej serwatki krowiej lub mleka krowiego metodą chromatografii jonowymiennej, ultrafiltracji w celu usunięcia składników o niskiej masie cząsteczkowej i suszenia rozpyłowego. Podczas tych zabiegów usuwane są laktoza i białka serwatkowe, w tym alfa-laktoalbumina i beta-laktoglobulina. Produkt końcowy zawiera około 78% białka (z czego 95% to OPN), maksymalnie 9% popiołu, do 5,5% wody oraz mniej niż 1% tłuszczu i laktozy.

Osteopontyna (OPN) to wielofunkcyjne białko obecne w większości tkanek i płynów ustrojowych, przy czym najwyższe jego stężenia występują w mleku. Ma plejotropowe (wielofunkcyjne) znaczenie dla organizmów żywych. Występuje w tkankach i płynach ustrojowych w całym królestwie zwierząt. Nazwę osteopontyny utworzono od greckiego słowa „osteo” (kość) oraz łacińskiego słowa „pons” (most). Wynika to z jej funkcji łączenia komórek ze zmineralizowaną fazą kości. Ze względu na wielofunkcyjność tego białka i zaangażowanie w różne procesy fizjologiczne występuje ono pod różnymi nazwami: sialoproteina kostna I, fosfoproteina, uropontyna lub laktopontyna. Po raz pierwszy osteopontynę opisano w 1979 r. jako białko związane z transformacją komórek nabłonkowych. W 1988 r. została po raz pierwszy wyizolowana z mleka ludzkiego, a w 1989 r. – zarówno w postaci nienaruszonej formy, jak i fragmentów powstałych prawdopodobnie w efekcie rozszczepienia proteolitycznego w mleku. Po kilku latach, w 1993 r., wyizolowano OPN również z mleka bydlęcego.

Osteopontyna należy do grupy glikoprotein fosforylowanych zawierających sekwencje Arg-Gly-Asp i SVVYGLR wiążących integrynę (białko transbłonowe łączące cytoszkielet komórki). Osteopontyna jest kluczowym składnikiem różnych procesów fizjologicznych, takich jak hamowanie zwapnienia ektopowego (naczyń), przebudowa kości, przerzuty raka oraz aktywność immunomodulacyjna. Ma również znaczenie w procesie fagocytarnego unieszkodliwiania różnych szczepów bakterii, co daje potencjał w obronie immunologicznej w infekcji patogenami, a także zmniejsza tworzenie się biofilmu nazębnego poprzez wiązanie się z powierzchnią komórek bakteryjnych. Dzięki temu, że wykazuje oporność na proteolizę soków żołądkowych noworodków, jest ważnym czynnikiem w aktywacji układu odpornościowego niemowląt. 

Osteopontyna jest izolowana z frakcji mleka stabilnej w warunkach wysokiej temperatury i w kwaśnym środowisku, dlatego też jest bardzo odporną glikoproteiną wykazującą stabilność termiczną w temperaturze 90°C, ponadto nie podlega proteolizie w soku żołądkowym przy pH 3,0 przez 1 godzinę w temperaturze 37°C. Osteopontyna poddaje się modyfikacjom poprzez fosforylację, glikozylację i obróbkę proteolityczną, co wpływa na istnienie jej licznych izoform. Ponadto bydlęca osteopontyna ma charakter kwaśny przez dużą ilość ujemnie naładowanych aminokwasów i liczne fosforylacje – cecha ta stymuluje do tworzenia kompleksów z jonami wapnia, co może hamować niezamierzone wytrącanie fosforanu wapnia w mleku. W konsekwencji w badaniach modelowych na myszach wykazano wpływ osteopontyny na hamowanie zwapnienia naczyń. Ponadto wykazano jej zdolność do tworzenia kompleksów z laktoferyną, laktoperoksydazą i immunoglobuliną IgM, co sugeruje działanie ochronne na te składniki przed proteolizą przy transporcie przez żołądek. 

Strukturalnie ludzka osteopontyna zawiera 298 aminokwasów, zaś bydlęca 262, z tego 182 aminokwasy (61%) są identyczne (homologiczne). Struktura ludzkiego i bydlęcego OPN jest bardzo podobna pod względem ogólnej identyczności sekwencji, pozycjonowania fosforylacji i glikozylacji, motywów wiążących integryny (receptory błon komórkowych) i miejsc rozszczepienia proteolitycznego. W mleku ludzkim zawartość osteopontyny wynosi średnio 138 µg/ml, zaś w bydlęcym – 18 µg/ml. Dla przykładu w osoczu i moczu dorosłego człowieka stężenie osteopontyny wynosi odpowiednio 35 ng/ml i 4 µg/ml, z kolei osocze bydlęce zawiera 40 ng/ml. Co ciekawe, poziom osteopontyny w osoczu i pępowinie niemowlęcia jest nawet 10-krotnie wyższy niż w osoczu dorosłego człowieka. Dodatkowo wykazano znaczne różnice zawartości OPN w mleku pomiędzy duńskimi krowami rasy holsztyńskiej, gdzie zawartości wahały się od 0,4 mg/l do 67,8 mg/l. Wykazano, że poziom OPN zmniejszał się wraz z kolejnym porodem, zaś początkowo wzrastał z kolejnym dniem laktacji. Potwierdzono również, że zawartość OPN w mleku krów duńskich rasy holsztyńskiej jest sterowana dziedzicznie. 

Te wartości były podstawą do wnioskowania o istotności suplementowania osteopontyną żywności żywienia początkowego. Powszechnie wiadomo, że mleko kobiece jest optymalnym źródłem pożywienia i wspiera zdrowie i rozwój noworodków. Mleko kobiece zawiera nie tylko niezbędne makroelementy, ale także związki bioaktywne. Pomimo ciągłego udoskonalania preparatów do początkowego żywienia niemowląt, naśladujących skład mleka kobiecego, wyniki dotyczące wzrostu, zdrowia i rozwoju neurologicznego niemowląt karmionych mieszanką różnią się od tych uzyskiwanych u niemowląt karmionych piersią. Mleko kobiece zawiera stosunkowo wysokie stężenie osteopontyny (OPN) w porównaniu z dostępnymi na rynku preparatami dla niemowląt. Jako silnie fosforylowana glikoproteina z sekwencją wiążącą integrynę, OPN jest syntetyzowana w różnych tkankach i występuje w wielu różnych izoformach białka. Dlatego OPN jest wielofunkcyjnym białkiem zaangażowanym w takie procesy, jak proliferacja i różnicowanie komórek kostnych, przebudowa kości i reakcje przeciwzapalne, w niektórych warunkach również prozapalne. W badaniach kontrolowanych i randomizowanych przebadano dzieci w wieku od 1 do 6 miesięcy i porównano wyniki trzech grup karmionych piersią i karmionych mieszanką bez osteopontyny i wzbogaconą osteopontyną na poziomie 65 mg/l lub 130 mg/l. Niemowlęta karmione mieszanką suplementowaną w OPN miały zbliżoną zawartość cytokin w osoczu do niemowląt karmionych piersią i jednocześnie zmniejszoną zawartość cytokiny prozapalnej. Jednocześnie nie stwierdzono różnic w apetycie, wzroście, masie ciała pomiędzy różnymi grupami niemowląt. Co ciekawe, jeśli niemowlęta otrzymujące preparat zawierający OPN gorączkowały, to liczba dni gorączki była mniejsza w porównaniu do grupy dzieci otrzymujących standardową mieszankę. Aktywność osteopontyny wynika z faktu, że jest ona silną cytokiną, aktywną w wielu procesach zapalnych. W kilku badaniach wykazano, że endogenne wydzielanie OPN w komórkach odpornościowych lub komórkach nabłonka jelit wpływa na stan bariery jelitowej w normalnej i chorej tkance. W prawidłowo funkcjonującym jelicie osteopontyna bierze udział w jelitowej homeostazie immunologicznej. Zaburzenia bariery nabłonkowej koreluje z niższą ekspresją OPN w komórkach nabłonka. W badaniach na gryzoniach wykazano, że ostre zapalenie jelita grubego i niska podaż osteopontyny z pokarmem były skorelowane z większym zniszczeniem tkanki i osłabionym procesem naprawczym tkanek. Aplikacja OPN z wodą pitną istotnie łagodziła skutki wywołane zapaleniem jelita grubego. Badania wykazują, że osteopontyna z mleka wpływa na produkcję cytokin w komórkach jelitowych i morfologię komórek jelitowych, w tym na powierzchnię jelit, co w konsekwencji może zwiększyć wchłanianie składników odżywczych i działać łagodząco na choroby zapalne jelit. Inne badania sugerują, że OPN z mleka aplikowana w diecie może odgrywać rolę w procesach komórkowych mózgu i potencjalnie wpływać na aktywność kognitywną i zachowanie. Wykazano również, że podawanie OPN z żywnością zmniejsza adhezję bakterii (m.in. Actinomyces viscousus, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus oralis) oraz opóźnia tworzenie biofilmu na szkliwie zębów, co może wpływać istotnie na występowanie próchnicy i chorób przyzębia.

Osteopontyna obecna w mleku bierze udział w różnorodnych bioaktywnościach na wczesnym etapie życia. Zwiększa odporność na różne patogeny poprzez wiązanie się z integrynami. Integryny to glikoproteiny tworzące rodzinę transbłonowych receptorów adhezyjnych, których podstawowym zadaniem jest przekazywanie i odbieranie sygnałów mechanicznych, biochemicznych przez błonę w obu kierunkach. Odgrywają one istotną rolę w licznych procesach fizjologicznych, m.in. w różnicowaniu komórek, hemostazie, angiogenezie, inwazji nowotworów i gojeniu się ran. Integryny wykazują zdolność wiązania bardzo różnych białek, w tym kolagenu, plaminogenu, fibrynogenu i osteopontyny. Te kompleksy pełnią określone funkcje w odziaływaniach międzykomórkowych. Wyniki badań laboratoryjnych na zwierzętach, ludziach i niemowlętach pozwalają wnioskować, że osteopontyna podana doustnie jest imponująco wielofunkcyjną cząsteczką. Naprawia tkanki, regeneruje komórki, przyspiesza gojenie ran, a nawet regeneruje uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjne nerek (UNN). Potencjalne prozdrowotne aktywności ostepontyny przedstawiono na schemacie.

Wszechstronność bioaktywności osteopontyny jest i będzie przedmiotem kolejnych badań na poziomie mechanizmów molekularnych, które leżą u podstaw aktywności terapeutycznych cząsteczki. Jednak aktualny stan wiedzy i badania naukowe poddają analizie użycie ostepontyny w funkcji biomarkerów w różnych stanach chorobowych – m.in. zespole metabolicznym (w tym chorobach sercowo-naczyniowych, cukrzycy), alkoholowym uszkodzeniu wątroby – oraz przy diagnozie nowotworów. Opisywany wzrost endokrynnego stężenia osteopontyny w tkance nowotworowej jest rozpatrywany jako cenny marker monitorowania leczenia chorych, ponieważ wraz z progresją choroby w większości przypadków rośnie stężenie OPN w osoczu krwi chorych. Przeglądy literaturowe donoszą również, że zwiększenie stężenia OPN towarzyszy przerzutom nowotworowym. Aktywność OPN w tym zakresie związana jest z jej zdolnością do tworzenia kompleksów z integrynami – receptorami błony komórkowej. Dla przykładu połączenie OPN z konkretnymi integrynami ma istotne znaczenie w obserwacji tworzenia przerzutów w raku prostaty i piersi. Tym samym istotna jest analiza wpływu endogennej i egzogennej osteopontyny na bioaktywność wewnątrzustrojową.