Testy mikrobiologiczne: Szybkie testy wykrywające zanieczyszczenia mikrobiologiczne

mgr inż. Patrycja Cichońska
Forum Mleczarskie Biznes 3/2021 (44)
Katedra Technologii i Oceny Żywności,
Instytut Nauk o Żywności, SGGW Warszawa
© fm

Oferowanie bezpiecznych dla zdrowia i życia produktów jest w naszych czasach kwestią kluczową dla każdego producenta żywności. W przemyśle mleczarskim, ze względu na charakterystykę produktów, wyjątkowo ważne jest zapewnienie bezpieczeństwa mikrobiologicznego. Drobnoustroje przenoszone przez żywność są rocznie przyczyną około 20 mln przypadków zakażeń mikrobiologicznych na świecie. Mleko i produkty mleczne najczęściej mogą zostać skażone poprzez bakterie Campylobacter jejuni, Escherichia coli 0157: H7, Listeria monocytogenes i Salmonella enterica. Zakażenie żywności poprzez niepożądane drobnoustroje może doprowadzić nie tylko do skrócenia terminu przydatności do spożycia produktu, ale również do zagrożenia życia i zdrowia konsumenta. Niezwykle istotne jest wdrażanie kontroli i oceny jakości handlowej, zarówno artykułów spożywczych, jak i otoczenia produkcyjnego. Otrzymywanie wartościowych produktów mleczarskich, wykazujących prawidłowe właściwości, wymaga ich pozyskiwania, przetwarzania i przechowywania w określonych, bezpiecznych warunkach.

Do zakażenia żywności może dojść w wyniku niezachowania odpowiednich warunków higieny procesu przetwarzania w hali produkcyjnej. Odpowiedzialni producenci, w celu uzyskania produktu wysokiej jakości, bezpiecznego dla konsumentów, powinni stosować się do standardów dotyczących bezpieczeństwa mikrobiologicznego otoczenia produkcyjnego. Standardy te powinny uwzględniać specyfikę procesu technologicznego oraz wykorzystywane surowce i ich mikroflorę. Prawidłowe wdrożenie systemów GHP (ang. Good Hygienic Practice – Dobra Praktyka Higieniczna), GMP (ang. Good Manufacturing Pracitice – Dobra Praktyka Produkcyjna) i HACCP (ang. Hazard Analysis and Critical Control Points System – Analiza Zagrożeń i Krytyczne Punkty Kontroli) pozwala na zminimalizowanie ryzyka zanieczyszczenia żywności, głównie poprzez zastosowanie odpowiednich środków zapobiegawczych. GHP i GMP określają aspekty tj. lokalizacja zakładów produkcyjnych, rozmieszczenie pomieszczeń i wyposażenia w zakładzie, procedury mycia, dezynfekcji i konserwacji, zapewnienie bezpieczeństwa mikrobiologicznego, szkolenie i higiena osobista pracowników. System HACCP jest obecnie najskuteczniejszym narzędziem zmniejszającym ryzyko zatruć i zakażeń pokarmowych oraz bardzo ważnym czynnikiem wpływającym na budowanie wizerunku firmy. Jest to system, który umożliwia w sprawny sposób zapobieganie zakażeniom żywności na różnych etapach produkcji, poprzez wprowadzenie tzw. analizy krytycznych punktów kontrolnych (CCP – ang. Critical Control Points). System ten uwzględnia określenie postępowania mającego na celu oszacowanie zagrożeń wobec bezpieczeństwa żywności, działania pozwalające na eliminację lub ograniczenie ryzyka ich wystąpienia oraz podejmowane działania korygujące.

Niezwykle istotne jest, aby planując krytyczne punkty kontrolne w systemie HACCP uwzględnić zanieczyszczenia mogące pochodzić z otoczenia produkcyjnego, uwzględniając zanieczyszczenia pochodzące z powietrza, powierzchni produkcyjnych i roboczych oraz zanieczyszczenia pochodzące od personelu. Kluczowe jest wprowadzanie działań umożliwiających bieżącą kontrolę tych elementów, co w przypadku wykrycia nieprawidłowości pozwala na szybką i skuteczną reakcję, mającą na celu wyeliminowanie zagrożenia. W przemyśle spożywczym coraz popularniejsze są szybkie testy wykrywające obecność zanieczyszczeń mikrobiologicznych, nawet w kilka minut. Działania takie pozwalają na regularne monitorowanie bezpieczeństwa w zakładzie oraz ekspresowe wdrażanie działań korygujących, w przypadku wystąpienia zagrożenia.

Dla zakładów przetwórstwa spożywczego ważnym elementem monitorowania bezpieczeństwa mikrobiologicznego powinien być stan powietrza. Zanieczyszczenia powietrza stanowią zagrożenie nie tylko dla bezpieczeństwa produkowanej żywności, ale również dla zdrowia pracowników. Powietrze jest świetnym przenośnikiem dla drobnoustrojów, a jednocześnie miejscem dla ich tymczasowego bytowania, mimo że nie stwarza dla nich sprzyjającego środowiska do rozwoju. Do zanieczyszczenia powietrza może dojść w wyniku aktywności personelu w obszarze produkcyjnym, poprzez system kanalizacji, proces mycia oraz system wentylacji. Poprzez powietrze może dochodzić również do infekcji wtórnych, wynikających z kontaktu z surowcem i produktem, sprzętem, opakowaniami i aparaturą.

Bakterie i inne cząstki biologiczne (tj. wirusy, zarodniki grzybów, toksyny) zawieszone są w powietrzu w postaci kompleksów z materią nieożywioną, tworząc bioaerozol. Jest on w stanie przenosić się na duże odległości za pomocą systemów wentylacyjno-klimatyzacyjnych lub z prądami powietrza. W ten sposób mikroorganizmy mogą się rozprzestrzeniać i migrować po całym zakładzie przetwórczym, stwarzając ryzyko skażenia powierzchni produkcyjnych, surowca i gotowego produktu. Bioaerozole mogą stanowić od 5 do nawet 34% zanieczyszczeń powietrza wewnętrznego. W powietrzu pomieszczeń produkcyjnych obecna jest typowa mikroflora saprofityczna, w której dominują bakterie z rodzaju Bacillus i Micrococcus oraz grzyby z rodzaju Penicillium, Cladosporium i Aspergillus. Możemy tam również spotkać drobnoustroje patogenne takie jak np. pałeczki Salmonella spp., Escherichia coli, Listeria monocytogenes oraz gronkowce 1. Rodzaj tych patogenów zależy od rodzaju pomieszczenia produkcyjnego, liczby pracowników w danej strefie, środowiska zewnętrznego zakładu, wilgotności i temperatury otoczenia, a także stanu sanitarnego pomieszczeń. Badania jednoznacznie udowadniają, że stan mikrobiologiczny powietrza w hali produkcyjnej wpływa na jakość i trwałość produkowanej żywności. Szczególnie podatne na ryzyko zanieczyszczenia są produkty w przemyśle mleczarskim. Zanieczyszczenia mikrobiologiczne w zakładach produkcyjnych stanowią jednak nie tylko zagrożenie dla produktów, ale również dla pracowników zakładu, narażonych na ich codzienną ekspozycję. Narażenie personelu może być powodem wystąpienia zagrożeń zdrowotnych, począwszy od podrażnień i dolegliwości, poprzez reakcje alergiczne, aż po infekcje i choroby zakaźne.

Producenci żywności powinni dołożyć wszelkich starań, aby zminimalizować lub całkowicie wyeliminować zanieczyszczenia przenoszone przez powietrze wewnątrz hal produkcyjnych, ponieważ wysoka koncentracja bioaerozolu jest skutkiem zaniedbań w przestrzeganiu zasad higieny w przedsiębiorstwie. Standardowe metody hodowlane monitorowania jakości mikrobiologicznej powietrza obejmują metodę sedymentacyjną, zderzeniową, filtracyjną i elektrostatyczną. Metoda sedymentacyjna polega na osadzaniu się drobnoustrojów na powierzchni umieszczonych w określonych miejscach płytek z podłożem agarowym pod wpływem siły grawitacji. Szacuje się, że w czasie 5 minut ekspozycji na płytkę z podłożem o powierzchni 100 cm2 osiadają drobnoustroje znajdujące się w 10 l powietrza. Tak przygotowane płytki inkubuje się przez okres od 3 do 5 dni, w celu uzyskania wyników. W metodzie zderzeniowej wykorzystuje się wymuszone osiadanie drobnoustrojów na powierzchni podłoża. Efekt taki osiąga się poprzez zastosowanie aparatu, który zasysa określoną objętość powietrza, umożliwiając oznaczenie liczby drobnoustrojów przypadających na określoną objętość powietrza. W metodzie filtracyjnej określoną objętość powietrza przepuszcza się przez filtr membranowy lub płyn fizjologiczny. Filtr membranowy przenosi się na podłoże hodowlane, zaś płyn fizjologiczny posiewa na podłoże agarowe i inkubuje.

Wymienione testy standardowe mają ograniczone zastosowanie, ze względu na konieczność zachowania okresu inkubacji, który może trwać nawet kilka dni. W tym okresie może dojść do zakażenia produktu, co prowadzi do konieczności wycofania partii towaru z obrotu oraz uszczerbku na wizerunku firmy. W świetle konieczności uzyskiwania wyników oznaczeń czystości powietrza w krótkim czasie producenci coraz chętniej sięgają po szybkie testy diagnostyczne. Spośród komercyjnych testów badających czystość powietrza w zakładzie możemy wymienić np. LumAir LU45 firmy NuWave Sensors. Jest to czujnik szybkiego wykrywania drobnoustrojów (bakterii, drożdży i pleśni), który ułatwia zdalne monitorowanie patogenów w powietrzu. System pobiera próbki powietrza z otoczenia w odstępach 5-15 minut (w zależności od obiektu). Zarodniki i drobnoustroje zawieszone w powietrzu są unieruchamiane na matrycy we wkładzie, która jest stale monitorowana za pomocą systemu optycznego lasera. Pomiary gęstości optycznej na pożywkach ułatwiających wzrost określają, czy obecne jest zanieczyszczenie mikrobiologiczne. Czujnik ten znacznie skraca czas wykrywania zanieczyszczeń i automatyzuje proces pobierania próbek, monitorowania i wykrywania, eliminując konieczność czasochłonnej inkubacji. System umożliwia ciągłe monitorowanie i raportowanie zdarzeń zanieczyszczenia powietrza. Czujnik jest połączony z platformą monitorowania, a użytkownicy są stale informowani o stanie urządzenia za pośrednictwem portalu użytkownika online. Użytkownicy otrzymują automatyczne powiadomienia pocztą e-mail w przypadku zdarzenia zanieczyszczenia. LumAir LU45 jest w pełni zautomatyzowany i nie wymaga specjalistycznego szkolenia obsługi. Jeden pracownik może zarządzać dużą liczbą zainstalowanych jednostek, przy czym interwencja człowieka jest wymagana tylko w przypadku wykrycia zdarzenia zanieczyszczenia i konieczności wymiany wkładu.

Kolejnym narzędziem do bieżącego monitorowania czystości mikrobiologicznej powietrza w zakładzie produkcyjnym są systemy IMD-A 300 i 350 firmy BioVigilant. Systemy te w czasie rzeczywistym wykrywają zarówno rozmiar, jak i wewnętrzną fluorescencję cząstek zawieszonych w powietrzu, wyszukując cząsteczki biologiczne o wielkości zaledwie 0,5 mikrona. Drobnoustroje zawierają metabolity lub związki chemiczne, takie jak NADH, ryboflawina i kwas dipikolinowy (DPA). Po wzbudzeniu przez światło o określonej długości fali, związki te emitują wewnętrzny sygnał fluorescencyjny, który służy jako marker biologicznej zawartości próbki. Kiedy cząstka wchodzi w strefę badania systemu IMD-A, przecina wiązkę lasera. Obecność lub brak obecności wewnętrznej fluorescencji decyduje o tym, czy cząstka jest biologiczna, czy obojętna. Zasadę działania aparatu przedstawiono na rysunku. System oferuje gotowe środki do określania zawartości drobnoustrojów w próbce aerozolu, zapewniając w ten sposób ciągłą analizę obciążenia biologicznego środowiska. System IMD-A 300 pobiera powietrze z szybkością 1,15 l na minutę, a IMD-A 350 pobiera próbki powietrza z szybkością 28,3 l na minutę. Systemy te nie wymagają odczynników i okresu inkubacji próbek, a jedynie minimalnego zaangażowania operatora. Wyposażone są w oprogramowanie, które oferuje zarówno tryb ciągłego wykrywania, jak i tryb próbkowania punktowego w określonym czasie, umożliwiając użytkownikom określenie metody pobierania próbek, która najlepiej pasuje do specyfiki zakładu produkcyjnego.

© fm

Zagrożenia mikrobiologiczne w zakładach produkcyjnych występują również na różnego typu powierzchniach produkcyjnych oraz na rękach i ubraniach personelu. Często przyczynami obecności zanieczyszczeń na powierzchniach są źle przeprowadzone procesy mycia i dezynfekcji oraz nieprawidłowo zaprojektowane powierzchnie urządzeń i maszyn (ze szczelinami, pęknięciami, zarysowaniami), na których łatwo gromadzą się mikroorganizmy. Drobnoustroje najszybciej osiedlają się na wilgotnych powierzchniach, tworząc zespoły, tzw. biofilmy. W skład biofilmów wchodzą głównie bakterie, czasem również drożdże, grzyby strzępkowe i pierwotniaki. Ich tworzenie się na powierzchni np. maszyn i urządzeń produkcyjnych może stanowić nie tylko niebezpieczeństwo dla surowców i produktów, ale również poważny problem dla samego procesu technologicznego. Obecność ich może sprzyjać procesowi korozji, a także powodować ograniczony przepływ mediów, utrudnioną wymianę ciepła, wzrost tarcia na elementach ruchomych, zapychanie się filtrów i awarie urządzeń. Ważnym elementem zachowania higieny w zakładzie produkcyjnym jest również kontrola zanieczyszczeń mikrobiologicznych, których źródłem jest personel. W skład mikroflory skóry człowieka (zwłaszcza rąk) wchodzą bakterie z grupy coli, gronkowce koagulazo-ujemne i kaogulazo-dodatnie, enterokoki i inne ziarniaki. Według danych literaturowych człowiek jest źródłem ponad 25% wszystkich mikroorganizmów obecnych w powietrzu w środowisku produkcyjnym. Rodzaj mikroflory dłoni personelu różni się w zależności od rodzaju surowca, specyfiki linii produkcyjnej, czystości obsługiwanych maszyn i urządzeń oraz higieny osobistej pracowników. Osoby będące nosicielami chorób mogą stać się przyczyną skażenia całego zakładu produkcyjnego, w tym wytwarzanych produktów spożywczych. Sytuacja taka mogłaby spowodować zagrożenie zdrowotne dla konsumentów, straty materialne i wizerunkowe dla przedsiębiorstwa, a także stanowiłaby zagrożenie zdrowotne dla pozostałych pracowników zakładu.

Standardowe metody badania czystości powierzchni w zakładach produkcyjnych obejmują metodę wymazów (tamponową), odciskową oraz metodę pobrania suchej próby. Metoda wymazów stosowana jest do oceny zanieczyszczeń powierzchni trudnodostępnych, wilgotnych, zakrzywionych i małych. Za pomocą wymazówek (tj. tamponów z waty, gazy lub gąbki) pobiera się próby z powierzchni do badania. Pobraną próbę przenosi się do jałowego płynu do wymazów, a następnie posiewa na płytki z pożywką i inkubuje w odpowiedniej temperaturze i czasie. Metoda odciskowa wykorzystywana jest do oznaczania stopnia zanieczyszczenia mikrobiologicznego powierzchni gładkich i płaskich. W metodzie tej wykorzystuje się testy łopatkowe oraz specjalne płytki odciskowe o wypukłej powierzchni. Materiał pobrany na odpowiednie podłoże inkubuje się w określonym czasie i temperaturze. Wyniki otrzymuje się w zależności od typu płytki odczytując liczbę kolonii lub porównując gęstość wyrośniętej kolonii z dołączonymi wzorcami. Metoda pobrania suchej próby pozwala zaś na pobranie fragmentu badanego materiału, umieszczenia go w soli fizjologicznej, a następnie wykonania posiewu na odpowiednie podłoże selektywne. W standardowych działaniach kontroli higieny pracowników badaniom poddaje się najczęściej ich odzież oraz dłonie. Czystość odzieży sprawdza się na brzuchu, klatce piersiowej, przedramieniu i w miejscach narażonych na ucisk (łokcie, kolana). Badanie przeprowadza się metodą kontaktową za pomocą płytek odciskowych w podobny sposób, w jaki wykonuje się ocenę czystości mikrobiologicznej powierzchni. Czystość rąk pracowników bada się na wewnętrznej stronie dłoni, a jeśli pracownicy nie pracują w rękawiczkach, badanie wykonuje się na dłoni nieosłoniętej. Najczęściej do tego celu używa się płytek odciskowych, które następnie inkubuje się w odpowiednich warunkach. Po inkubacji (trwającej zazwyczaj 1-3 dni) zlicza się wyrosłe kolonie. Oznacza się przykładowo liczbę bakterii tlenowych mezofilnych, obecność gronkowców koagulazo-dodatnich czy też obecność pałeczek z rodziny Enterobacteriaceae.

W przypadku zastosowania standardowych metod kontroli mikrobiologicznej powierzchni oraz czystości rąk i odzieży personelu konieczne jest zachowanie okresu inkubacji, a wyniki otrzymujemy dopiero po kilku dniach, czyli w momencie, gdy badany czynnik wszedł w interakcje z systemem produkcji. Rozwiązaniem tego problemu jest zastosowanie szybkich testów pozwalających określić stan czystości biologicznej danego materiału/powierzchni w ciągu kilku minut, a nawet sekund. Spośród szybkich testów na wykrywanie obecności mikroorganizmów na powierzchniach i rękach/ubraniach pracowników wymienić możemy testy oparte na oznaczaniu obecności ATP oraz testy enzymatyczne. W tabeli przedstawiono charakterystykę szybkich testów do wykrywania mikroorganizmów na powierzchniach produkcyjnych oraz odzieży/dłoniach personelu.

Wykrywanie obecności ATP (adenozynotrifosforanu) w badanych próbkach wskazują na obecność różnych zanieczyszczeń organicznych (pozostałości roślinnych, zwierzęcych i mikroorganizmów). Metoda ta wykorzystuje reakcje hydrolizy ATP do ADP i ortofosforanu lub do AMP i pirofosforanu, gdzie uwalniana jest pewna ilość energii swobodnej, którą można zmierzyć jako emisję kwantów światła. Intensywność wydzielanego światła jest proporcjonalna do ilości ATP obecnego w komórkach organizmów. W każdej żywej komórce oraz materiałach pochodzenia biologicznego obecny jest ATP. Wielkość emisji światła mierzona jest za pomocą luminometru, a wynik podawany jest w postaci umownych jednostek świetlnych RLU (ang. Relative Light Unit). Do oceny wyznaczonych punktów pomiarowych metodą luminometrii otrzymane wyniki porównuje się z wartościami progowymi, uprzednio wyznaczonymi dla danej branży, danego zakładu i poszczególnych miejsc pomiarowych. Każdy luminometr zawiera komorę pomiarową, detektor, układ przetwarzający sygnał optyczny na elektryczny i podający wynik. Praktyczne zastosowanie w monitoringu higieny mają małe, przenośne luminometry, które umożliwiają wykonanie pomiarów już na obszarze produkcyjnym i otrzymanie wyniku pomiaru natychmiast. Obsługa luminometru zazwyczaj sprowadza się do otwarcia pojemnika z wymazówką, pobrania wymazu z badanej powierzchni, włożenia wymazówki do tego samego pojemnika, a następnie włożenia pojemnika z wymazówką do luminometru. Pomiar następuje automatycznie.

Testy enzymatyczne pozwalają na wykrycie specyficznych enzymów, a dzięki temu wykrycie określonych grup drobnoustrojów. Na rynku możemy spotkać m.in. testy enzymatyczne oparte na detekcji NADH/NADPH, a także testy na wykrycie obecności konkretnych grup drobnoustrojów. Testy oparte na oznaczaniu obecności dinukletydu nikotynoadeninowego (NAD, NADH) lub fosforanu dinukletydu nikotynoadeninowego (NADP, NADPH) polegają na detekcji reakcji enzymatycznej, której efektem jest powstanie zabarwienia na strefie reakcyjnej paska. Intensywność barwy jest wprost proporcjonalna do ilości badanych związków na badanej powierzchni. Wynik oznaczenia otrzymujemy już po 4-5 minutach. Metoda NADPH jest to metoda wyłącznie jakościowa, która stwierdza, że albo pozostałości materiału biologicznego są, albo ich nie ma. Jeśli na pasku testowym pojawi się jakikolwiek kolor, to niezależnie od jego natężenia oznacza to, że badana powierzchnia była zanieczyszczona (test wykrył pozostałości nikotynoamidu). Testy enzymatyczne pozwalające na wykrywanie określonych grup drobnoustrojów działają na podstawie reakcji enzymów drobnoustrojów z substancjami chemicznymi na pałeczkach wymazowych. W efekcie powstaje reakcja barwna sygnalizująca o obecności mikroorganizmów. Na rynku spotkać możemy przykładowo testy na wykrycie ogólnej liczby bakterii i testy na obecność bakterii tlenowych Gram-ujemnych. Wyniki otrzymujemy średnio po 20 minutach od wykonania oznaczenia.

Specyfika produkcji w zakładach mleczarskich stwarza dogodne warunki dla rozwoju mikroflory szkodliwej dla jakości produktów. Wpływ na bezpieczeństwo surowców i produktów w dużej mierze ma stan powietrza zakładu produkcyjnego, a także higiena powierzchni produkcyjnych i personelu zakładowego. Bardzo istotna jest systematyczna kontrola oraz ocena potencjalnych czynników zakaźnych, co pozwala na szybkie reagowanie w przypadku wykrycia nieprawidłowości. Bardzo pomocne w kontroli tych parametrów w zakładach produkcyjnych okazują się być szybkie testy do wykrywania zanieczyszczeń mikrobiologicznych. Dzięki nim możliwe jest wykonywanie regularnych pomiarów, których wyniki otrzymujemy w bardzo krótkim czasie. Pozwala to na natychmiastowe reagowanie na wszelkie wykryte uchybienia i zapobieganie zanieczyszczeniom surowców i produktów, minimalizując straty dla przedsiębiorstwa. Wdrażanie do zakładu produkcyjnego szybkich metod diagnostycznych uzależnione jest m.in. od dostępności wybranych metod, ich ceny oraz specyfiki zakładu produkcyjnego. Producenci powinni również pamiętać, że wdrożenie do zakładu produkcyjnego tego typu narzędzi wymaga ich walidacji w odniesieniu do metod standardowych o sprawdzonej skuteczności.

Literatura:

  1. Breza-Boruta B., Kroplewska M., Pastewska A., Szala B.: Źródła skażenia powietrza i zagrożenie szkodliwym bioareozolem w zakładach przetwórstwa rolno-spożywczego. Prace Naukowe Uniwersytetu Ekonomicznego we Wrocławiu 2017, 494.
  2. Czerwińska E., Piotrowski W.: Potencjalne źródła skażenia mleka wpływające na jego jakość spożywczą. Rocznik Ochrony Środowiska 2011, 13.
  3. Godlewska K.: Higiena: Szybkie testy do kontroli czystości powierzchni produkcyjnych. Forum Mleczarskie 2015, 1(20).
  4. Jakubczyk E.: Gospodarka powietrzem w mleczarniach. Część I. Źródła zanieczyszczeń powietrza. Przemysł Spożywczy 2000, 54(11).
  5. Kręgiel D.: Zastosowanie luminometrii w badaniach adhezji drobnoustrojów do powierzchni abiotycznych. Techniki i Metody 2016, 4.
  6. Olborska K., Lewicki P.: Organizacja procesu pakowania produktów mleczarskich i jej wpływ na stan mikrobiologiczny powietrza w hali produkcyjnej. Żywność 2006, 2(47).
  7. Sitarz S., Janczar-Smuga M.: Współczesne zagrożenia bezpieczeństwa żywności, możliwości ich kontroli oraz eliminacji. Nauki inżynierskie i technologie 2012, 2(5).