Wykrywanie drobnoustrojów: Tradycyjne i alternatywne metody wykrywania drobnoustrojów

Produkty mleczarskie ze względu na swoją charakterystykę biochemiczną stanowią doskonałe podłoże dla rozwoju różnego typu mikroorganizmów. Wynika to w głównej mierze z obecności takich składników jak cukry (stanowiące źródło węgla), białka (stanowiące źródło azotu) oraz witaminy i składniki mineralne. Jest to niezwykle istotne z punktu widzenia producenta, ponieważ według ustawy o bezpieczeństwie żywności z dnia 25 sierpnia 2006 r. (Dz. U. 171 poz. 1225) wraz z późniejszymi zmianami, całkowitą odpowiedzialność za jakość produkowanych i wprowadzanych do obrotu środków spożywczych ponosi producent.

Do zakażenia produktów mleczarskich może dojść na różnych etapach – w miejscu hodowli bydła mlecznego (drobnoustroje obecne w wodzie, paszy i otoczeniu zwierząt), w wyniku błędów technologicznych w czasie przetwarzania, czy poprzez pracowników zakładu przetwórstwa. W przypadku produktów mleczarskich to właśnie zagrożenia mikrobiologiczne stanowią najczęstszą grupę zagrożeń (w porównaniu z zagrożeniami fizycznymi i chemicznymi). Jako najważniejsze zagrożenia mikrobiologiczne w produktach mleczarskich zidentyfikowano drobnoustroje: Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Salmonella i Escherichia coli. W przypadku serów miękkich i półmiękkich największym zagrożeniem są enterotoksyny L. monocytogenes i S. aureus (zwłaszcza gdy proces fermentacji jest opóźniony lub początkowa liczba komórek w mleku jest wysoka), podczas gdy mleko surowe jest najczęściej kojarzone z chorobotwórczymi bakteriami E. coli i Campylobacter spp. W przypadku produktów mlecznych w proszku Cronobacter spp. i Salmonella spp. można uznać za najbardziej niepokojące zagrożenie mikrobiologiczne, zwłaszcza w przypadku preparatów w proszku przeznaczonych dla niemowląt w wieku poniżej 6. miesiąca życia.

W Polsce dokumentem prawnym regulującym obecność drobnoustrojów w mleku i produktach mlecznych jest Rozporządzenie Komisji (WE) NR 2073/2005 z dnia 15 listopada 2005 r., w sprawie kryteriów mikrobiologicznych dotyczących środków spożywczych. Rozporządzenie to „ustanawia kryteria mikrobiologiczne dotyczące niektórych mikroorganizmów oraz przepisy wykonawcze obowiązujące przedsiębiorstwa sektora spożywczego przy wdrażaniu ogólnych i szczegółowych zasad higieny dla środków spożywczych, o których mowa w art. 4 rozporządzenia (WE) nr 852/2004”. Dokument ten obejmuje parametry jakości mikrobiologicznej w odniesieniu do dwóch aspektów – bezpieczeństwa żywności oraz wskaźników higieny procesu.

W aspekcie bezpieczeństwa żywności dla przemysłu mleczarskiego uwzględniono kryterium obecności enterotoksyny gronkowcowej oraz drobnoustrojów Listeria monocytogenes, Salmonella spp. i Enterobacter sakazakii. Kryteria badań bezpieczeństwa żywności dla poszczególnych grup produktów mleczarskich, wraz z zalecanym etapem produkcji żywności i referencyjną metodą przeprowadzania badania przedstawiono w tabeli 1.

W aspekcie wskaźników higieny procesu dla przemysłu mleczarskiego uwzględniono kryterium obecności drobnoustrojów Enterobacteriaceae, E. coli i gronkowców koagulazo-dodatnich. Kryteria badań wskaźników higieny procesu dla poszczególnych grup produktów mleczarskich, wraz z zalecanym etapem produkcji żywności i referencyjną metodą przeprowadzania badania podano w tabeli 2.

Przedstawione powyżej kryteria badań uwzględniają zalecane referencyjne metody badań dla wykrywania obecności poszczególnych drobnoustrojów w żywności. Przeprowadzenie tego typu badań wymaga zastosowania znormalizowanych metod badawczych, określających parametry, takie jak: sposób pobierania i przygotowania próbek do badań, postępowanie analityczne oraz sposób formułowania wyniku. Dla badań mikrobiologicznych żywności najczęściej stosowanymi normami są normy międzynarodowe (ISO) i europejskie (EN), które zazwyczaj zostają zharmonizowane z normami polskimi (PN). Jednakże według Rozporządzenia Komisji (WE) 2073/2005, laboratoria i przedsiębiorstwa przemysłu spożywczego mogą wykorzystywać alternatywne metody analityczne, w tym szczególnie tzw. szybkie metody identyfikacyjne. Warunkiem jest równoważność wyników pozyskanych takimi metodami z wynikami pozyskanymi metodami znormalizowanymi, co musi zostać udowodnione procedurą walidacji.

Potrzeba wykorzystywania metod alternatywnych wynika z czasochłonności i złożoności metod standardowych. Metody standardowe oparte są głównie na wykonywaniu posiewów na określonych pożywkach (stałych lub płynnych), co wymaga regularnej kontroli ich jakości i związanego z tym dodatkowego nakładu pracy. Taki proces wykrywania drobnoustrojów realizowany jest ręcznie i wymaga zachowania określonego okresu inkubacji. W związku z powyższym na wyniki oznaczeń metodą standardową trzeba czekać nawet od 3 do 5 dni. W przemyśle mleczarskim, oferującym m.in. produkty o krótkim terminie przydatności do spożycia, istotne jest otrzymywanie wyników analiz mikrobiologicznych w jak najkrótszym czasie. Fakt ten skłania producentów do stosowania metod szybszych, pozwalających jednocześnie na otrzymanie wyników dokładnych i wiarygodnych.

Spośród alternatywnych metod wykrywania drobnoustrojów w produktach mleczarskich wymienić możemy szybkie biochemiczne testy diagnostyczne (testy płytkowe, pałeczkowe i paskowe), testy automatyczne działające w oparciu o technologię cytometrii przepływowej oraz testy oparte na technologiach molekularnych (techniki oparte na PCR, metoda LAMP, metoda oparta na HTS). Narzędzia te różnią się czułością oraz czasem otrzymania wyniku oznaczenia.

Spośród szybkich biochemicznych testów diagnostycznych możemy wyróżnić testy płytkowe, pałeczkowe i paskowe. Działanie testów płytkowych opiera się na zdolności drobnoustrojów do asymilacji, fermentacji i rozkładu określonych związków chemicznych. Takie testy oferowane są w postaci gotowych zestawów pożywek umieszczonych na płytkach z tworzywa lub papieru, z ewentualnym dodatkiem wskaźnika barwnego. Na pożywki umieszczone na płytkach nanosi się rozcieńczoną próbkę i inkubuje w określonych warunkach. W porównaniu z metodą standardową pracochłonność i szybkość tej metody jest dwukrotnie mniejsza, przy podobnym koszcie wykonania analiz. Dostępne są płytki z różnego typu podłożami, gdzie zastosowano specyficzne barwne substraty oraz wskaźniki, które ulegając hydrolizie pod wpływem wytwarzanych przez bakterie enzymów, przekształcane są do barwnych produktów. Dodatkowo, w skład podłoża często wchodzi nie jeden, a kilka barwnych substratów, co umożliwia rozróżnienie na jednym podłożu kilku rodzajów drobnoustrojów jednocześnie. Zastosowanie testów płytkowych pozwala na znaczne ograniczenie sprzętu badawczego i zaoszczędzenie cennej przestrzeni laboratoryjnej w zakładzie produkcyjnym.

Przykładem komercyjnie dostępnych testów płytkowych są płytki 3M Petrifilm firmy 3M. Firma posiada w ofercie 16 różnych testów płytkowych, dostosowanych do wykrywania różnego typu drobnoustrojów w żywności. Płytki te są gotowe do użycia od razu po otwarciu opakowania, co pozwala wyeliminować etap przygotowywania podłoży agarowych. Płytki zawierają rozpuszczalny w wodzie środek żelujący, w postaci ustandaryzowanej mieszaniny substancji odżywczych i barwnych. Do każdego rodzaju płytek, dodane są tablice interpretacyjne ułatwiające analizę uzyskanych wyników. Produkty są walidowane zgodnie z normą ISO 16140.

W pałeczkowych testach diagnostycznych wykorzystywane są zazwyczaj reakcje enzymatyczne zachodzące pomiędzy syntetycznymi substratami a enzymami produkowanymi przez drobnoustroje obecne w badanej próbce żywności. Reakcja ta, po połączeniu z czynnikiem wywołującym kolor powoduje, że na pasku pojawia się zabarwienie, wskazujące na obecność danego drobnoustroju. Przykładem komercyjnie dostępnych paskowych testów diagnostycznych są testy EnZquik firmy Pol-Skór. Grupa testów EnZquik obejmuje testy na ogólną liczbę drobnoustrojów oraz testy na obecność bakterii Gram-ujemnych. W przypadku testów na ogólną liczbę drobnoustrojów wynik oznaczenia w postaci koloru purpurowego lub niebieskiego na pałeczce wymazowej wskazuje na wynik pozytywny. Wynik pozytywny oznacza to, że w badanej próbce obecne jest minimum 1000 cfu (ang. colony-forming unit – jednostek tworzących kolonię). Wykonanie testu trwa zaledwie 20 minut i może on stanowić wskazówkę do wykonania dalszych oznaczeń w celu wykrycia drobnoustrojów patogennych. W przypadku testów na obecność bakterii Gram-ujemnych wynik oznaczenia w postaci koloru fioletowego na pałeczce wymazowej wskazuje na wynik pozytywny (obecne jest minimum 1000 cfu). Oba testy przeznaczone są do wykrywania bakterii bezpośrednio z powierzchni, w tym również z powierzchni żywności.

Paskowe testy diagnostyczne najczęściej wykorzystywane są do badania skuteczności pasteryzacji produktów mlecznych. Przykładem komercyjnego testu tego typu jest The MaxSignal Dairy Pasteurization Verification Kit firmy Perkin Elmer. Test ten wykorzystuje kolorymetryczny mechanizm enzymatyczny do pomiaru obecności enzymu fosfatazy alkalicznej w próbkach mleka, w celu określenia skuteczności procesu pasteryzacji (w mleku poprawnie spasteryzowanym obecność tego enzymu nie powinna zostać wykryta). Procedura jest czuła i szybka – może wykryć zanieczyszczenie mleka surowego nawet na poziomie

Artur Gąsior

Zarządzający Grupą Produktów Przemysłowych – Europa Wschodnia w bioMérieux Polska

Obecnie każdy producent żyw­ności powinien zdawać sobie sprawę, że zachowanie bezpie­czeństwa produktu, jest jednym z najważniejszych celów jego firmy. Informacje o wszelkiego rodzaju zakażeniach czy zanieczyszczeniach żywności są bardzo szybko nagła­śniane i rozpowszechniane, bowiem skażone produkty żywnościowe mogą stanowić bezpośrednie zagrożenia dla zdrowia i życia konsumentów. Ma to również ogrom­ne znaczenie dla funkcjonowania całej firmy, ponieważ w krótkim czasie może stać się przyczyną znacznych strat wizerunkowych, a w konsekwencji także finan­sowych. Firma bioMérieux od lat współpracuje z naj­większymi na świecie producentami żywności. Dzięki wprowadzaniu na rynek nowoczesnych i specjalistycz­nych rozwiązań każdego dnia jesteśmy gotowi pomagać różnym producentom w zachowaniu najlepszej jakości ich wyrobów. Każdy zakład produkcyjny jest inny i ma także inne potrzeby, z tego względu zespół specjalistów bioMérieux nie tylko wdraża najróżniejsze rozwiązania, ale doradza Państwu w doborze odpowiedniej metody (klasycznej lub alternatywnej). Ponadto nasi specjaliści mogą pomóc w określeniu liczby prób, które powinny być badane, w jaki sposób je badać oraz skąd je pobie­rać. W ofercie firmy bioMérieux dostępny jest m.in. apa­rat Tempo, wykorzystywany do określania wskaźników jakości, który może precyzyjnie określić ogólną liczbę drobnoustrojów, liczbę drożdży i pleśni, liczbę Entero­bacteriacae czy innych mikroorganizmów. Aparat ten automatyzuje cały proces dzięki czemu wyniki uzyskuje się już po 24 godzinach i nie ma potrzeby ich potwier­dzania czy interpretowania. Jest to szczególnie istotne w obecnych czasach, kiedy zauważamy problemy z do­stępem do wykwalifikowanej kadry czy koniecznością pracy zmianowej. Jednak aparat Tempo jest tylko jed­nym z wielu aparatów dostępnych dla przemysłu mle­czarskiego. W zależności od potrzeb firma bioMérieux może zaproponować rozwiązania do wykrywania pa­togenów (np. aparat Vidas czy RT-PCR Gene-Up) lub cytometry przepływowe typu D-Count wykorzystywane do kontroli jakościowej produktów. Jednakże jednym z największych wyzwań w obecnym czasie nie jest wy­krycie mikroorganizmów, ale wcześniejsze oszacowanie ryzyka i określenie, jakie były drogi ich transmisji. Dzięki temu możliwe jest przeprowadzenie skutecznych działań korygujących i zapobieganie wystąpieniu potencjalnego zanieczyszczenia żywności. Wdrażając zaproponowane rozwiązania do pracy rutynowej mogą Państwo znacznie poprawić bezpieczeństwo produktu, a tym samym lepiej chronić konsumentów oraz markę firmy.

W wielu laboratoriach przemysłu mleczarskiego stosuje się również automatyczne analizatory mleka surowego. Urządzenia te służą głównie do oznaczenia liczby komórek somatycznych i ogólnej liczby drobnoustrojów w mleku surowym, które wykorzystywane jest do dalszego przerobu. Jest to rozwiązanie innowacyjne w porównaniu do standardowo wykorzystywanych metod (jak np. testy przeprowadzane z użyciem szalki Petriego lub płytek Petrifilm), które pozwalały na otrzymanie wyników po około 2-3 dniach, a procedura opierała się na subiektywnym zliczaniu jednostek tworzących kolonię w polu widzenia. Urządzenia do automatycznej analizy działają w oparciu o technologię cytometrii przepływowej, a wynik oznaczenia otrzymujemy w ciągu zaledwie kilku minut. Przykładami komercyjnych urządzeń tego typu są BactoScan FC+ firmy Foss oraz BactoSense firmy Gremes. Urządzenia te umożliwiają wdrażanie szybkich działań w celu zachowania i poprawy jakości mleka zarówno w laboratorium mleczarskim, jak i u samego hodowcy bydła mlecznego. Stosunkowo niewielkie rozmiary i mobilność urządzenia umożliwiają dostęp do powszechnej metody kontroli jakości mleka.

Kolejną grupą testów stosowanych w przemyśle mleczarskim są testy oparte na technologiach molekularnych (techniki oparte na PCR, metoda LAMP, metoda oparta na HTS). W porównaniu z innymi dostępnymi technikami analitycznymi, metody molekularne wyróżnia znacznie większa czułość i dokładność oraz, w zależności od badanego mikroorganizmu, skrócenie czasu do otrzymania wyniku negatywnego już od 12 do 24 godzin. Niewątpliwą zaletą tego typu testów jest fakt, że wskazują one na obecność konkretnych rodzajów drobnoustrojów, nie informując jedynie o ogólnej liczbie drobnoustrojów w próbce.

Coraz większą popularnością w wykrywaniu drobnoustrojów w żywności cieszą się metody oparte na technice PCR (ang. Polymerase Chain Reaction – łańcuchowa reakcja polimerazy), które umożliwiają powielanie konkretnych odcinków DNA drobnoustrojów w warunkach laboratoryjnych. Jedną z odmian tej metody jest real-time PCR, czyli PCR w czasie rzeczywistym. W metodzie PCR następują po sobie cyklicznie kolejne etapy przetwarzania materiału genetycznego próbki, w wyniku czego otrzymujemy selektywnie powielony poszukiwany odcinek kwasu nukleinowego. Real-time PCR umożliwia jednoczesne namnażanie DNA oraz monitorowanie ilości powielonych produktów. Wzrost ilości kopii DNA w czasie rzeczywistym śledzimy bezpośrednio na ekranie urządzenia (termocyklera) lub podłączonego do niego komputera. Metody te wykorzystywane są do wykrywania w żywności takich bakterii, jak Yersinia enterocolitica, Campylobacter sp., Listeria sp., Listeria monocytogenes, Escherichia coli oraz Salmonella sp. Drobnoustroje identyfikowane są na podstawie swojego DNA, dzięki czemu wynik oznaczenia jest obiektywny i dokładny (umożliwia odróżnienie laboratoryjnych szczepów na podstawie nawet niewielkich różnic w sekwencji ich materiału genetycznego). Całkowity czas analizy wraz z etapami nieselektywnego namnożenia i izolacji DNA mieści się w 24 godzinach. Real-Time PCR oraz klasyczny PCR są technikami czulszymi niż metody tradycyjne. Metoda Real-Time PCR pozwala na uzyskanie graficznych, łatwych w interpretacji wyników, nie wymaga rozdziału elektroforetycznego. Wykorzystanie tych metod pozwala na znaczne przyspieszenie i zwiększenie dokładności wykrywania patogenów w produktach mleczarskich. Spośród wad tej metody możemy natomiast wyróżnić wysoki koszt aparatury niezbędnej do przeprowadzenia analiz oraz wrażliwość na inhibitory, obecne w składnikach badanych produktów żywnościowych. Kwestie wykorzystania metody PCR w sektorze produkcyjnym regulują normy PN-EN ISO 22174, PN-EN ISO 20838, PN-EN ISO 22118 i ISO 22119. Normy te określają właściwy sposób wykorzystania metody PCR w zakładzie produkcyjnym i w laboratorium akredytowanym. Wskazują na to jak wdrożyć, walidować i jak prawidłowo pracować z tą metodą. Przykładem firmy komercyjnej oferującej swoje usługi w zakresie odpowiedniego doboru metodyki i sprzętu laboratoryjnego do przeprowadzania analiz metodą PCR, jest firma Sterbios, oferująca aparaturę Thermo Fisher Scientific.

Kolejną metodą detekcji drobnoustrojów w żywności, opartą na technologiach molekularnych jest metoda LAMP (ang. Loop-Mediated Isothermal Amplification). Jest to metoda (podobnie jak metoda z PCR) wykorzystująca technologię opartą na amplifikacji i wykrywaniu specyficznych sekwencji DNA. Polega na izotermicznej reakcji amplifikacji kwasów nukleinowych, jednak eliminuje konieczność wykorzystywania kosztownych termocyklerów. Jej wysoka czułość i specyficzność umożliwiają przeprowadzenie szybkiej, wydajnej oraz niskonakładowej amplifikacji specyficznej sekwencji DNA patogenów w żywności. Metoda LAMP znacznie usprawnia amplifikację wybranych odcinków DNA oraz pokonuje niektóre ograniczenia technik PCR. Technika ta wykorzystuje jeden protokół badawczy dla wszystkich badanych drobnoustrojów, a wszystkie reakcje przeprowadzane są w jednakowej temperaturze. Wykazują wysoką specyficzność, a odczyt wyników przeprowadzany jest za pośrednictwem pomiaru bioluminescencji, dzięki czemu nie jest wrażliwy na inhibitory obecne w badanej próbce żywności9. W literaturze naukowej można znaleźć wiele publikacji wskazujących na duży potencjał wykorzystania techniki LAMP do sprawnej i dokładnej diagnostyki drobnoustrojów chorobotwórczych w przemyśle spożywczym. Metoda ta cieszy się coraz większym zainteresowaniem i jest z powodzeniem wdrażana w laboratoriach przyzakładowych oraz laboratoriach akredytowanych w skali globalnej. Jest ona rekomendowana przez wiele niezależnych organów kontrolnych, np. Departament Rolnictwa Stanów Zjednoczonych (USDA). Przykładem urządzeń komercyjnych umożliwiających badanie żywności z zastosowaniem techniki LAMP są urządzenia 3M Molecular Detection System firmy 3M. Dzięki nim możliwe jest zbadanie próbki żywności pod kątem obecności m.in. takich drobnoustrojów jak Salmonella, E. coli, Listeria monocytogenes, czy Campylobacter.

Spośród molekularnych technologii wykrywania drobnoustrojów możemy również wymienić powoli wyłaniającą się na rynku innowacyjną metodę opartą o wysokoprzepustowe sekwencjonowanie DNA (HTS – ang. high-throughput DNA sequencing). Według badaczy technika ta może być wykorzystywana jako skuteczne narzędzie do dokładnej identyfikacji mikroorganizmów w łańcuchu przetwarzania produktów mleczarskich. Mikroorganizmy ze środowiska mogą dostać się do łańcucha przetwarzania produktów mleczarskich na wielu etapach, w tym podczas odbioru i przetwarzania mleka, co może mieć potencjalne konsekwencje dla jakości i bezpieczeństwa produktu końcowego. Możliwość śledzenia wędrówki tych mikroorganizmów można znacznie zwiększyć dzięki zastosowaniu wysokoprzepustowego sekwencjonowania DNA. Technika ta polega na izolacji i porównaniu DNA z materiału biologicznego pobranego na wszystkich etapach łańcucha produkcyjnego. Możliwe jest zidentyfikowanie tysięcy mikroorganizmów w czasie jednej analizy. Otrzymane wyniki identyfikowane są wobec biblioteki drobnoustrojów. Na ich podstawie przeprowadzona zostaje analiza bioinformatyczna, dzięki której otrzymujemy szczegółowy raport z badania. Uzyskane wyniki przedstawiają charakterystykę mikroflory występującej na określonych etapach produkcji. Możliwa jest szybka, stosunkowo tania, kompleksowa i powtarzalna weryfikacja bioróżnorodności towarzyszącej procesowi produkcyjnemu. Technikę HTS można stosować do śledzenia gatunków drobnoustrojów, od surowego mleka, poprzez przetwarzanie, aż po końcowe produkty. Rutynowe wdrażanie techniki HTS pozwoli producentom na dokładniejsze identyfikowanie zagrożeń biologicznych w całym łańcuchu produkcyjnym i umożliwi zaplanowanie środków kontrolnych i zapobiegawczych właściwych dla każdego etapu przetwarzania. Działania takie doprowadzą do lepszego zrozumienia i kontroli mikroflory oraz wyznaczenia etapów w łańcuchu produkcyjnym lub obszarów z zakładzie produkcyjnym, gdzie konieczne jest podjęcie działań zmierzających do poprawy stosowanych praktyk higienicznych. Taka strategia może ostatecznie doprowadzić do zwiększenia bezpieczeństwa i jakości produkowanej żywności.

Produkty przemysłu mleczarskiego, ze względu na swoją charakterystykę, muszą podlegać restrykcyjnym kontrolom pod względem bezpieczeństwa mikrobiologicznego. Wyzwaniem dla producentów jest wybranie takiej metody badania bezpieczeństwa i higieny produkowanej żywności, która pozwoli na przeprowadzanie szybkich i dokładnych analiz, z uwzględnieniem aspektów ekonomicznych i opłacalności obranych metod. Obecnie można zauważyć, że w laboratoriach przyzakładowych coraz częściej rezygnuje się ze standardowych metod wykrywania drobnoustrojów na rzecz metod alternatywnych. Zastosowanie alternatywnych metod z pewnością pozwoli na znaczne przyspieszenie całej procedury oznaczania, ale również umożliwi zwiększenie dokładności i obiektywności analiz.

Literatura

1. Asselt E.D., Fels-Klerx H.J., Marvin H.J., Bokhorst-van de Veen H., Groot M.: Overview of Food Safety Hazards in the European Dairy Supply Chain. Comprehensive reviews in food science and food safety 2016, 16.
2. Kwiatek K. Kukier E., Goldsztejn M: Normy metodyczne w badaniach mikrobiologicznych łańcucha żywnościowego. Życie Weterynaryjne 2014, 89.
3. McHugh J.A., Feehily C. Fenelon M.A., Gleeson D., Hill C., Cotter P.D.: Tracking the Dairy Microbiota from Farm Bulk Tank to Skimmed Milk Powder. mSystem 2020, 5.
4. Misiewicz A., Goncerzewicz A.: Wykrywanie bakterii Salmonella metodami molekularnymi w produktach żywnościowych. Zeszyty Problemowe Postępów Nauk Rolniczych 2013, 573.
5. Osek J., Kowalczyk A., Wieczorek K.: Molekularne metody wykrywania i identyfikacji chorobotwórczych bakterii w żywności. Medycyna Weterynaryjna 2005, 61.
6. Paniel N., Noguer T.: Detection of Salmonella in Food Matrices, from Conventional Methods to Recent Aptamer-Sensing Technologies. Foods 2019, 8.
7. Rozporządzenie Komisji (WE) nr 2073/2005 z dnia 15 listopada 2005 r. w sprawie kryteriów mikrobiologicznych dotyczących środków spożywczych.
8. Ustawa z dnia 25 sierpnia 2006 r. o bezpieczeństwie żywności i żywienia.
9. Yang Q., Domesle K.J., Beilei G.: Loop-Mediated Isothermal Amplification for Salmonella Detection in Food and Feed: Current Applications and Future Directions. Foodborne Pathogens and Disease 2018, 15.