Bakteriocyny w przemyśle mleczarskim: Wykorzystanie bakteriocyn w przemyśle mleczarskim

mgr inż. Patrycja Cichońska
Forum Mleczarskie Biznes 3/2021 (44)
© fm

Obecnie na rynku produktów spożywczych obserwujemy coraz większą popularność żywności jak najbardziej zbliżonej do naturalnej, minimalnie przetworzonej, o świeżym wyglądzie oraz smaku, a jednocześnie wysokim poziomie bezpieczeństwa. W odpowiedzi na panujące trendy producenci skłaniają się ku ograniczaniu lub nawet zastępowaniu inwazyjnych zabiegów (takich jak obróbka termiczna), czy stosowanie tradycyjnych substancji konserwujących, kosztem zabiegów mało inwazyjnych, jednak zapewniających bezpieczeństwo i korzystne właściwości sensoryczne produktów. Coraz większą popularnością cieszą się metody nietermiczne oraz dodatek do produktów spożywczych naturalnych substancji przeciwdrobnoustrojowych.


W produkcji żywności niezwykle istotne jest podjęcie odpowiednich środków zapewniających jej bezpieczeństwo i stabilność w okresie przydatności do spożycia. Konserwacja żywności ma na celu zachowanie jakości oraz właściwości fizykochemicznych i funkcjonalnych surowca, przy jednoczesnym zapewnieniu bezpiecznego i stabilnego produktu. Mleko, ze względu na swój skład i właściwości, stanowi dobrą pożywkę dla rozwoju wielu mikroorganizmów chorobotwórczych. Zanieczyszczenie mikrobiologiczne mleka jest przyczyną strat ekonomicznych na różnych etapach łańcucha produkcji wyrobów mleczarskich. Zastosowanie wybranych naturalnych związków przeciwdrobnoustrojowych jest atrakcyjną, bezpieczną i opłacalną alternatywą mogącą zapobiegać psuciu się mleka i produktów mlecznych. Duże zainteresowanie wzbudza stosowanie środków przeciwdrobnoustrojowych, takich jak bakteriocyny, wytwarzane głównie przez bakterie kwasu mlekowego. Środki te wykazują potencjalne właściwości biokonserwujące, co umożliwia ograniczenie stosowania chemicznych środków konserwujących.

Istnieje kilka mikroorganizmów wytwarzających bakteriocyny, jednak do poznanych i najszerzej badanych należą bakteriocyny syntetyzowane przez bakterie kwasu mlekowego (LAB – ang. lactic acid bacteria). Są one szczególnie interesujące dla przemysłu mleczarskiego. Bakterie kwasu mlekowego to grupa bakterii Gram-dodatnich, wytwarzających kwas mlekowy na drodze fermentacji. Do tej grupy należą m.in. rodzaje Lactococcus, Lactobacillus, Leuconostoc, Enterococcus, Pediococcus, Streptococcus, Weisella. Są to bakterie najczęściej stosowane jako kultury starterowe do przemysłowego wytwarzania fermentowanych produktów mleczarskich, mięsnych, owocowych, warzywnych i zbożowych. LAB wykazują działanie hamujące przeciwko drobnoustrojom patogennym, takim jak Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis i Salmonella typhimurium.

LAB są ogólnie uważane za bezpieczne do spożycia przez ludzi. Większość z nich posiada status GRAS (ang. generally recognized as safe). LAB są od dawna stosowane w procesie fermentacji żywności, w trakcie którego przekształcają węglowodany w kwas mlekowy. Podczas procesu fermentacji produkowane są również metabolity, wykazujące działanie konserwujące. Spośród tych metabolitów możemy wyróżnić inne kwasy organiczne, diacetyl, acetoinę, nadtlenek wodoru, peptydy przeciwgrzybicze i bakteriocyny. Metabolity produkowane przez szczepy LAB, można podzielić, ze względu na rozmiar cząsteczki, na dwie główne grupy – substancje o niskiej (poniżej 1000 Da) i wysokiej (powyżej 1000 Da) masie cząsteczkowej. Bakteriocyny należą do grupy substancji o wysokiej masie cząsteczkowej. Dodatek bakteriocyn ma na celu hamowanie obecnej w żywności mikroflory patogennej. Za bezpieczne uważane jest stosowanie do żywności bakteriocyn syntetyzowanych przez szczepy bakterii fermentacji mlekowej takich jak Lactococcus sp., Lactobacillus sp., Pediococcus sp., Carnobacterium sp., czy Leuconostoc sp.

© fm

Bakteriocyny to peptydy syntetyzowane na rybosomach, wytwarzane przez bakterie Gram-dodatnie i Gram-ujemne wykazujące działanie przeciwdrobnoustrojowe i zazwyczaj wydzielane na zewnątrz komórki bakteryjnej. Historia bakteriocyn sięga wczesnych lat 20. XX wieku, a ich działanie przeciwbakteryjne zostało odkryte po raz pierwszy w 1928 r., W latach 60. XX wieku pojawiła się pierwsza bakteriocyna (o nazwie nizyna), wytwarzana przez Lactococcus lactis subsp. lactis, która została oczyszczona i uznana za konserwant żywności przez FAO/WHO w 1969 r. Bakteriocyny mogą mieć działanie bakteriobójcze, czyli eliminować określone mikroorganizmy lub mogą działać bakteriostatycznie, czyli hamować wzrost niektórych mikroorganizmów. Substancje te działają przeciwko wielu rodzajom drobnoustrojów (w szerokim spektrum) lub przeciwko określonym gatunkom (w wąskim spektrum). Stanowią grupę związków o zróżnicowanych właściwościach biochemicznych, masie cząsteczkowej, mechanizmie działania, spektrum aktywności oraz lokalizacji i sekwencji genu kodującego aktywne białko. Mikroorganizmy wytwarzające wybrane bakteriocyny wykazują jednocześnie odporność na nie. Początkowo obserwowano głównie bakteriocyny skuteczne przeciwko blisko spokrewnionym gatunkom, jednak obecnie zidentyfikowano wiele związków należących do tej grupy, które mają szerokie spektrum działania i hamują wzrost zarówno szczepów Gram-ujemnych, jak i Gram-dodatnich.

Bakteriocyny produkowane przez LAB mają działanie przeciwbakteryjne, są powszechnie uznawane za bezpieczne (posiadają status GRAS) i atrakcyjne dla przemysłu spożywczego ze względu na ich aktywność przeciwko kluczowym Gram-dodatnim patogenom wywołującym choroby przenoszone przez żywność, tj. Listeria monocytogenes i Staphylococcus aureus. W związku z tym są coraz częściej stosowane jako naturalne środki konserwujące żywność. Większość bakteriocyn wytwarzanych z LAB, w szczególności te hamujące bakterie Gram-dodatnie, wywiera działanie przeciwbakteryjne poprzez mechanizmy związane z oddziaływaniem na błonę komórkową bakterii. Stabilność bakteriocyn może być jednak zróżnicowana, a ich aktywność zależy od warunków fizycznych, chemicznych i biologicznych danego środowiska. Przykładem może być działanie enterocyn na komórki Listeria monocytogenes. Zmiana charakteru aktywności z biobójczej na biostatyczną zależy w tych samych warunkach temperaturowych od składu żywności.

W żywności o alkalicznym odczynie (np. jajach) biobójcza aktywność bakteriocyn jest niska. Wysoka aktywność biostatyczna bakteriocyn jest natomiast obserwowana w żywności o niskich wartościach pH, np. fermentowanych produktach mlecznych, takich jak kwasowo-podpuszczkowe sery twarogowe, jogurty i sery podpuszczkowe dojrzewające.

W przemyśle spożywczym bakteriocyny mogą być stosowane w formie oczyszczonej, częściowo oczyszczonej lub w postaci bakteriocynogennych kultur starterowych. Bakteriocyny mogą być dostarczane do żywności poprzez zaszczepienie produktów spożywczych bakteriami fermentacji mlekowej, które wytwarzają bakteriocyny w produkcie, poprzez wprowadzanie oczyszczonej bądź częściowo oczyszczonej bakteriocyny lub też poprzez wprowadzenie do żywności produktu wcześniej sfermentowanego z wykorzystaniem bakterii mających zdolność do produkcji bakteriocyn. Ocena zastosowania bakteriocyn jako dodatków do żywności wymaga oszacowania ich odporności na ciepło, biorąc pod uwagę powszechność stosowania obróbki termicznej w produkcji żywności. Największą liczbę badanych i zidentyfikowanych bakteriocyn stanowią peptydy przeciwdrobnoustrojowe bakterii Gram-dodatnich. Szczegółowe informacje na temat poszczególnych bakteriocyn można naleźć w bezpłatnej bazie danych Bactibase, która w całości poświęcona jest bakteriocynom. Zawiera ona prawie 177 sekwencji bakteriocyn, z których 156 należy do szczepów bakterii Gram-dodatnich, a pozostałe 18 do Gram-ujemnych.

Klasyfikacja bakteriocyn opiera się na zróżnicowaniu struktury chemicznej, masy cząsteczkowej, wrażliwości na działanie enzymów, obecności modyfikowanych aminokwasów oraz mechanizmie działania. Wyróżniamy bakteriocyny bakterii Gram-dodatnich i Gram-ujemnych. Bakteriocyny produkowane przez bakterie Gram-dodatnie mają wielkość około 2-6 kDa i na ogół są peptydami kationowymi. Zidentyfikowano cztery główne klasy bakteriocyn tego typu (tabela 1). Klasa I obejmuje lantybiotyki, czyli termostabilne peptydy o masie cząsteczkowej

Bakteriocyny klasy II to bakteriocyny nielantybiotykowe. Obejmują peptydy małe (

Do bakteriocyn klasy III należą nietrwałe termicznie antybiotyki peptydowe o masie cząsteczkowej >30 kDa. Większość tych bakteriocyn jest wytwarzana przez bakterie należące do rodzaju Lactobacillus, w tym helwetycyna J wytwarzana przez Lactobacillus helveticus 481 i laktacyna B wytwarzana przez Lactobacillus acidophilus. Ich mechanizm działania obejmuje rozkład wrażliwych komórek poprzez wspomaganie hydrolizy ich ściany komórkowej. Bakteriocyny tej klasy są mniej interesujące w odniesieniu do ich wykorzystania do konserwacji żywności. Klasa IV to cykliczne peptydy, które do działania wymagają grup węglowodanowych lub lipidowych. Przykładem są bakteriocyny takie jak leukocyna S i laktocyna 27.

© fm

Obszar badań nad wykorzystaniem bakteriocyn jako naturalnych konserwantów żywności najczęściej obejmują bakteriocyny tj. nizyna, pediocyny i enterocyny. Nizyna ma stosunkowo długą historię bezpiecznego stosowania i udokumentowaną skuteczność w zwalczaniu istotnych Gram-dodatnich patogenów z rodzaju Listeria, Staphylococcus i Mycobacterium, oraz bakterii przetrwalnikujących Bacillus i Clostridium. Nizyna jest klasyfikowana jako peptyd podklasy I A, wytwarzany przez Lactococcus lactis subsp. lactis. Wykazano, że nizyna jest skuteczna w zwalczaniu drobnoustrojów wielu produktów mlecznych, a jej zastosowanie zostało szeroko docenione w produkcji serów. Pediocyny zalicza się do klasy II bakteriocyn, znanych również jako bakteriocyny „antylisterialne”, wytwarzane przez Pediococcus spp. Ważną cechą pediocyn jest ich stabilność w złożonych środowiskach. Zastosowanie pediocyn w żywności stanowi dobrą alternatywę dla ochrony przed patogenami przenoszonymi przez żywność i może w przyszłości zostać zaakceptowane przez konsumentów w taki sposób, w jaki została przyjęta nizyna. Enterocyny to grupa bakteriocyn wytwarzanych przez rodzaj Enterococci, należący do grupy Gram-dodatnich bakterii kwasu mlekowego. Bakteriocyny te wykazują działanie bakteriobójcze w stosunku do patogenów i mikroorganizmów powodujące psucie się żywności, w tym Listeria monocytogenes, Clostridium sp., E. coli, Vibrio cholerae, Staphylococcus aureus i Bacillus cereus.

Spośród bakterii Gram-ujemnych zdolność do wytwarzania bakteriocyn mają bakterie z rodziny Enterobacteriaceae, które wytwarzają bakteriocyny klasyfikowane jako kolicyny i mikrocyny (tabela 1). Kolicyny są syntetyzowane przez bakterie z rodzajów Escherichia, Shigella i Serratia. Wykazują aktywność antymikrobiologiczną wobec blisko spokrewnionych szczepów bakterii, które posiadają receptor wiążący kolicyny i nie wytwarzają białek odpornościowych wobec nich. Synteza kolicyn jest uruchamiana w warunkach stresowych. Mikrocyny wytwarzane są przez większość bakterii z rodziny Enterobacteriaceae i wykazują aktywność antymikrobiologiczną wobec blisko spokrewnionych szczepów. Dzielą się one na dwie klasy – peptydy o masie

Bakteriocyny są stosowane w konserwacji różnych produktów spożywczych, samodzielnie lub w połączeniu z innymi metodami. Bakteriocyny produkowane przez bakterie kwasu mlekowego wykorzystywane są do konserwacji produktów mleczarskich, głównie serów oraz produktów fermentowanych (tabela 2). Wybrane bakteriocyny, których dodatek do produktów mleczarskich wywarł efekt konserwujący (głównie poprzez przedłużenie trwałości i ograniczenie liczby bakterii Listeria monocytogenes) przedstawiono w tabeli 2. W Polsce jako substancja konserwująca do żywności wykorzystywana jest nizyna (symbol E234). Zgodnie z Rozporządzeniem Komisji (UE) NR 1129/2011 z dnia 11 listopada 2011 r. zmieniającym załącznik II do rozporządzenia Parlamentu Europejskiego i Rady (WE) nr 1333/2008 poprzez ustanowienie unijnego wykazu dodatków do żywności nizyna jest stosowana w mleczarstwie do produkcji serów dojrzewających i topionych (maksymalny poziom 12,5 mg/kg) oraz do serów mascarpone i clotted cream (maksymalny poziom 10 mg/kg).

W produkcji wyrobów mleczarskich jednym z głównych problemów mikrobiologicznych jest zanieczyszczenie Listeria monocytogenes. Mimo że większość produktów mlecznych, w szczególności serów, jest wytwarzanych z mleka pasteryzowanego, nadal występuje zanieczyszczenie tymi drobnoustrojami. Sery są produktami przechowywanymi głównie w temperaturach chłodniczych, które pozwalają na przeżycie i wzrost bakterii psychrotrofowych. Wykazano skuteczność nizyny przeciwko Listeria monocytogenes w produktach mleczarskich (serach twarogowych, serach typu ricotta, serach cheddar i pasteryzowanych serach topionych). Innym problemem w produkcji sera jest związana z Clostridium fermentacja kwasu masłowego. Nizyna jest powszechnie dodawana do pasteryzowanych serów topionych do smarowania, aby zapobiec wzrostowi zarodników Clostridium tyrobutyricum.

Wykazano, że nizyna jest skuteczna w zwalczaniu drobnoustrojów wielu produktów mleczarskich, a jej zastosowanie zostało szeroko ocenione w produkcji serów o niskim pH. Wydaje się, że zastosowanie kultur starterowych wytwarzających nizynę i odpornych na nizynę jest realnym sposobem na wprowadzenie i utrzymanie tej bakteriocyny w procesie produkcji sera w celu zwalczania patogennych i powodujących psucie bakterii przenoszonych przez żywność. Szczep Lactococcus lactis subsp. lactis został określony jako użyteczna kultura starterowa lub dodatek do serów półtwardych z mleka surowego lub pasteryzowanego, zapewniający ochronę przed skażeniem przez Staphylococcus aureus. W serze Cheddar zarówno dodatek szczepów Lactococcus. lactis ssp. cremoris i Lactococcus lactis ssp. lactis wytwarzających nizynę, jak i dodatek samej sproszkowanej nizyny bez kultury starterowej pozwala kontrolować zanieczyszczenie mikrobiologiczne.

Bakteriocyny mogą być również stosowane do zwalczania przypadkowej mikroflory niewchodzącej w skład kultury starterowej, m.in. w serach, przyczyniając się w ten sposób do jakości produktu końcowego. Bakteriocyny mogą być stosowane w celu poprawy bezpieczeństwa, wydłużenia okresu trwałości produktu, kontroli mikroflory fermentacyjnej, przyspieszenia fermentacji, przyspieszenia dojrzewania sera, a nawet poprawy jego smaku. Bakteriocynogenne szczepy bakterii fermentacji mlekowej mogą być wykorzystywane również jako kultury pomocnicze, równolegle z kulturą startową. Taki szczep musi posiadać zdolność do wzrostu w warunkach wytwarzanych przez szczepy z kultury startowej oraz nie wykazywać antagonistycznej aktywności w stosunku do nich. Badania wskazują, że szczep Lactococcus lactis, mający zdolność do syntezy nizyny i laktycyny 481 może być wykorzystywany do wspomagania aktywności kultur startowych używanych w produkcji wyrobów mlecznych, w celu ograniczenia wzrostu niepożądanych drobnoustrojów.

Idealna bakteriocyna powinna być skuteczna w niskich stężeniach, aktywna przeciwko szeregowi mikroorganizmów patogennych i powodujących psucie się żywności, nieszkodliwa dla człowieka i ekonomiczna w produkcji. Stosowanie bakteriocyn jako dodatków do żywności, wymaga dokładnej oceny skutków toksykologicznych ich stosowania przed ich zatwierdzeniem prawnym. W Polsce jedyną stosowaną bakteriocyną w żywności jest nizyna (dostępna m.in. pod nazwą handlowa Nisaplin), zaś w innych krajach dopuszczone są również pediocyna PA-1 (znana jako Alta 2341) czy karnocyklina A (znana pod nazwą handlową Mycocin).

Pomimo ostatnich postępów w badaniach nad bakteriocynami do zastosowań spożywczych, ich zastosowanie w przemyśle mleczarskim bywa jednak ograniczone. Bakteriocyny wykazują w żywności umiarkowane działanie przeciwdrobnoustrojowe, głównie redukując bakterie Listeria monocytogenes. Uważa się, że związki te stosowane samodzielnie nie są w stanie całkowicie uchronić żywności przed zepsuciem się i w pełni zabezpieczyć jej przed rozwojem drobnoustrojów chorobotwórczych. Rozwiązaniem tego problemu jest zastosowanie bakteriocyn w technologii płotków. Skuteczność działania bakteriocyn można zwiększyć m.in. poprzez stosowanie ich w połączeniu z kilkoma innymi bakteriocynami, wraz ze związkami uszkadzającymi zewnętrzną warstwę ściany komórkowej bakterii Gram-ujemnych (np. EDTA, enzymy), w połączeniu z termicznymi (ogrzewanie) i nietermicznymi metodami konserwowania żywności (wysokie ciśnienia, pulsacyjne pole elektryczne, pakowanie w modyfikowanej atmosferze, pakowanie próżniowe). Powszechne stosowanie bakteriocyn w technologii płotków mogłoby przynieść wiele korzyści, przede wszystkim ekonomicznych. Korzyści te mogą być następstwem złagodzenia parametrów termicznej obróbki surowca, obniżenia ilości stosowanych konserwantów chemicznych oraz redukcji kosztów ponoszonych przez zakład produkcyjny w związku z psuciem się żywności. Takie ich zastosowanie może również spowodować zwiększenie atrakcyjności sensorycznej i poprawę bezpieczeństwa zdrowotnego produktów.

Powszechną strategią konserwowania żywności spożywanej na surowo lub bez zaawansowanej obróbki technologicznej jest nakładanie jadalnych filmów lub powłok, zawierających substancje przeciwdrobnoustrojowe. Włączenie związków przeciwdrobnoustrojowych, takich jak bakteriocyny, do jadalnych powłok i błon stanowi interesującą alternatywę dla zapobiegania patogennym mikroorganizmom w produktach spożywczych. W większości przypadków bakteriocyny są adsorbowane w matrycach żywnościowych i łatwo ulegają degradacji, co powoduje utratę działania przeciwbakteryjnego. Hydrokoloidy to najdokładniej zbadane biopolimery w jadalnych powłokach i foliach nakładanych na ser. Ułatwiają wprowadzanie związków funkcjonalnych tj. bakteriocyny i bakterie wytwarzające bakteriocyny oraz pozwalają na zwiększenie stabilności i bezpieczeństwa oraz wydłużenie okresu przydatności do spożycia produktów.

Obecnie badania w zakresie bakteriocyn są ukierunkowane na poszukiwanie nowych i skuteczniejszych peptydów, a także na optymalizację istniejących bakteriocyn w celu rozwiązania problemów biologicznych i ekonomicznych. Nizyna pozostaje bakteriocyną o najszerszym zastosowaniu komercyjnym. Ze względu na fakt, że bakterie kwasu mlekowego i ich metabolity od wieków są spożywane jako składniki żywności bez skutków ubocznych, drobnoustroje te są preferowanym źródłem bakteriocyn stosowanych w żywności. Stosowanie bakteriocyn w żywności wiąże się z koniecznością odpowiedniej adnotacji na opakowaniu produktu, co może zniechęcać konsumentów do zakupu produktów utrwalanych przy ich wykorzystaniu. Istotne jest edukowanie konsumentów o oddziaływaniu bakteriocyn na żywność oraz o ich bezpieczeństwie do spożycia przez ludzi w celu zwiększenia zaufania do metod utrwalania żywności tego typu.

Literatura:

  1. Bharti V., Mehta A., Singh S., Jain N., Ahirwal L., Mehta S.: Bacteriocin: a novel approach for preservation of food. International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences 2015, 7(9), 20-29.
  2. Chen H., Hoover D.G.: Bacteriocins and their Food Applications. Comprehensive reviews in food science and food safety 2003, 2, 82-100.
  3. Gwiazdowska D., Trojanowska K.: Bakteriocyny – właściwości i aktywność przeciwdrobnoustrojowa. Biotechnologia 2005, 1(8), 114-130.
  4. Kumar N., Kumar V. Waheed S.M., Pradhan D.: Efficacy of Reuterin and Bacteriocins Nisin and Pediocin in the Preservation of Raw Milk from Dairy Farms. Food Technology & Biotechnology 2020, 58(4), 359-369.
  5. Rozporządzenie Komisji (UE) Nr 1129/ 2011 z dnia 11 listopada 2011 r. zmieniające załącznik II do rozporządzenia Parlamentu Europejskiego i Rady (WE)
  6. 1333/2008 poprzez ustanowienie unijnego wykazu dodatków do żywności.
  7. Sidhu P.K., Nehra K.: Bacteriocins of Lactic Acid Bacteria as Potent Antimicrobial Peptides against Food Pathogens. Intech Open 2021.
  8. Silva C.C., Silva S.M., Ribeiro S.C.: Application of Bacteriocins and Protective Cultures in Dairy Food Preservation. Frontiers in Microbiology 2018, 9, 594.
  9. Sip A., Krasowska M., Więckowicz M.: Zastosowanie bakteriocyn klasy lla bakterii fermentacji mlekowej. Biotechnologia 2009, 5(86), 129-147.
  10. Sobrino-Lopez A., Martin-Belloso O.: Use of nisin and other bacteriocins for preservation of dairy products. International Dairy Journal 2008, 18, 329-343.
  11. Steinka I.: Innowaje technologiczne a bezpieczeństwo żywności. Annales Academiae Medicae Gedanensis 2009, 39, 123-132.
  12. Tomaszewska M., Grzesińska W., Bilska B., Trafiałek J.: Charakterystyka bakteriocyn jako naturalnych konserwantów żywności. Postępy Techniki Przetwórstwa Spożywczego 2014, 1, 84-89.
  13. Zielińska D., Rzepkowska A., Ołdak A., Kołożyn-Krajewska D.: Właściwości przeciwdrobnoustrojowe i bezpieczeństwo bakterii fermentacji mlekowej, jako kryterium stawiane nowoczesnym szczepionkom do żywności. Innowacyjne rozwiązania w technologii żywności i żywieniu człowieka 2016.