Biofilm: Biofilm jako zagrożenie w produkcji mleczarskiej

Mleko jest produktem łatwo psującym się i bardzo wrażliwym na zanieczyszczenie mikrobiologiczne. Wytwarzanie mleka spożywczego oraz różnego rodzaju produktów mleczarskich wymaga zastosowania procesów technologicznych z wykorzystaniem szerokiej gamy maszyn i urządzeń produkcyjnych. Jednym z głównych źródeł zanieczyszczeń tych produktów jest niewłaściwie oczyszczony i zdezynfekowany sprzęt. W przemyśle mleczarskim niezwykle istotne jest zagwarantowanie wysokiego standardu higieny produkcji, który umożliwia otrzymanie produktów bezpiecznych i w jak najmniejszym stopniu zanieczyszczonych. W tym celu konieczne jest stosowanie procedur mycia oraz dobór odpowiednich maszyn i urządzeń, które minimalizują możliwość zanieczyszczenia. Mikroorganizmy mogą gromadzić się na powierzchniach instalacji i powierzchniach produkcyjnych, tworząc tzw. biofilm, który może stać się źródłem zanieczyszczenia stanowiącego zagrożenie dla producentów i konsumentów żywności.

Biofilmy to złożone ekosystemy mikrobiologiczne powstające zwykle na twardych powierzchniach, na których dochodzi do agregacji komórek drobnoustrojów połączonych ze sobą zewnątrzkomórkowymi substancjami polimerowymi. Jest to złożona, zróżnicowana społeczność, a proces jej powstawania można uznać za unikalny w biologii ze względu na skoordynowane działania stosunkowo niewielkich organizmów. Różne typy wirusów, bakterii i grzybów współistnieją w naturalnych biofilmach. Są one zanurzone w matrycy składającej się z zewnątrzkomórkowych substancji polimerowych (EPS – ang. extracelluar polymeric substances), zawierających głównie polisacharydy, białka i DNA. Matryca zapewnia korzyści strukturalne i funkcjonalne mikroorganizmom biofilmu, w tym nawodnienie, pobieranie i trawienie składników odżywczych, ochronę przed niekorzystnymi warunkami środowiskowymi oraz wymianę informacji genetycznej. EPS odpowiada za przyleganie biofilmu do powierzchni, spoistość, stabilność mechaniczną, ochronę i adaptację do stresów środowiskowych.

Obecność biofilmu mikrobiologicznego na powierzchniach w przemyśle spożywczym jest uważana za zagrożenie dla zdrowia ze względu na fakt, że oprócz bakterii nieszkodliwych może on zawierać mikroorganizmy chorobotwórcze. Bezpośredni kontakt z produktami spożywczymi może spowodować wtórne zanieczyszczenie, przez które produkt stanie się niebezpieczny. Biofilmy tworzone są zazwyczaj przez różne gatunki mikroorganizmów. W przemyśle mleczarskim najczęściej spotykane bakterie w biofilmie należą do rodzajów Enterobacter, Lactobacillus, Listeria, Micrococcus, Streptococcus, Bacillus i Pseudomonas. Najbardziej niebezpieczne są bakterie chorobotwórcze, które mogą gromadzić się w biofilmach i po dostaniu się do produktu stanowić bezpośrednie zagrożenie dla zdrowia konsumentów. Należą do nich m.in. Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Liste-ria monocytogenes, Campylobacter spp., Salmonella spp. i Enterobacter sakazakii. Na szczególną uwagę zasługują również bakterie z rodzaju Pseudomonas, które są głównymi mikroorganizmami ograniczającymi okres przydatności do spożycia produktów mleczarskich. Mogą one rozwijać się w warunkach chłodniczych i wiele z nich wytwarza termostabilne enzymy (lipazy, proteazy), które mogą przetrwać procesy obróbki termicznej i przyczyniają się do szybszego psucia się produktu oraz zmiany właściwości organoleptycznych.

Tworzenie biofilmu jest procesem złożonym i dynamicznym. Na tempo i sposób jego tworzenia wpływa wiele czynników, w tym m.in. rodzaj i gatunek drobnoustrojów, pH, stężenie składników odżywczych, tekstura powierzchni, hydrofobowość powierzchni, temperatura, prędkość strumienia cieczy i ciśnienie osmotyczne. Proces ten obejmuje jednak zazwyczaj kilka głównych etapów.

1. Adhezja – na tym etapie pojedyncze komórki drobnoustrojów osadzają się na powierzchniach. Na adhezję bakterii duży wpływ ma dostępność w otoczeniu składników odżywczych, które mogą osadzać się na powierzchniach, np. w wyniku nieprawidłowego procesu mycia i dezynfekcji. Proces ten zachodzi w dwóch etapach. Początkowo dochodzi do adhezji odwracalnej, czyli słabej interakcji pomiędzy ścianą komórkową drobnoustrojów a podłożem, która jest możliwa dzięki wytwarzaniu przez drobnoustroje białek ułatwiających przyczepienie się do powierzchni. Na tym etapie drobnoustroje można łatwo usunąć, np. w trakcie procesu mycia. Drugi etap to adhezja nieodwracalna, w której dochodzi do trwałego przyczepienia się drobnoustrojów do podłoża. Komórki wegetatywne namnażają się, wytwarzając EPS, który ułatwia trwałe wiązanie mikroorganizmów. Na tym etapie usuwanie komórek drobnoustrojów wymaga znacznie silniejszych sił, takich jak szorowanie lub zeskrobywanie.
2. Tworzenie mikrokolonii – nieodwracalnie przyczepione komórki bakteryjne rosną i dzielą się, wykorzystując składniki odżywcze obecne w podłożu i otaczającym płynnym środowisku. Tworzone są mikrokolonie, które powiększają się i łączą, a ich działalność metaboliczna przyczynia się do tworzenia warstwy śluzu pokrywającej powierzchnię. W tym czasie przyczepione komórki nadal wytwarzają EPS, który pomaga w przyczepianiu się kolejnych komórek do powierzchni i ochrania kolonię przed szkodliwymi warunkami środowiska. Komórki drobnoustrojów pozostają zakorzenione w matrycy EPS w wielu warstwach, które zapewniają im odżywianie. Do powstałych kolonii przyczepiają się również różnego rodzaju substancje organiczne i nieorganiczne z przepływających przez urządzenia cieczy, które stanowią pokarm dla rozwijających się drobnoustrojów. 
3. Tworzenie biofilmu – ciągłe przyczepianie się komórek bakteryjnych do powierzchni i późniejszy ich wzrost wraz z towarzyszącą produkcją EPS tworzy biofilm. Skład biofilmu jest niejednorodny ze względu na kolonizację różnych mikroorganizmów o różnych wymaganiach pokarmowych. Biofilm nie występuje jako jednolita warstwa na całej powierzchni. Dalszy wzrost rozmiaru biofilmów następuje poprzez osadzanie się lub przyłączanie innych organicznych i nieorganicznych substancji rozpuszczonych oraz cząstek stałych do biofilmu z otaczającej fazy ciekłej. Biofilmy mieszane gatunkowo są często grubsze i bardziej stabilne niż biofilmy jednogatunkowe. Jest to duży, złożony i zorganizowany ekosystem bakteryjny, w którym kanały wodne są rozproszone, zapewniając przejścia do wymiany składników odżywczych, metabolitów i produktów przemiany materii.
4. Odrywanie i rozprzestrzenianie się biofilmu – wraz ze starzeniem się biofilmu przyczepione bakterie, aby przetrwać i skolonizować nowe nisze, muszą być w stanie odłączyć się i rozproszyć od biofilmu. Uwolnione bakterie mogą zostać przeniesione w nowe miejsce i ponownie uruchomić proces tworzenia biofilmu.

Na powstawanie i rozwój biofilmów ma wpływ wiele czynników, w tym właściwości powierzchni oraz parametry środowiskowe, tj. pH, obecność poszczególnych składników odżywczych i temperatura. Mleko jest bardzo dobrą pożywką dla wzrostu mikroorganizmów ze względu na prawie neutralne pH i szeroką gamę dostępnych składników odżywczych. Zanieczyszczenia mikrobiologiczne mogą niekorzystnie wpływać na jakość, funkcjonalność i bezpieczeństwo produktów wytwarzanych przez przemysł mleczarski. Biofilmy nie tylko zanieczyszczają żywność, ale również przyczyniają się do pogorszenia jej jakości w wyniku działania różnych enzymów drobnoustrojów, takich jak lipazy i proteazy. Biofilm pochodzący z urządzeń przetwórczych uważany jest za jedno z głównych źródeł zanieczyszczenia mleka i produktów mleczarskich. Mikroorganizmy, odrywając się od biofilmu w trakcie przetwarzania produktów, mogą je zanieczyszczać lub infekować dalsze elementy urządzenia. Sprzyja to zakażeniom poprodukcyjnym i odpowiada za skrócenie okresu przydatności do spożycia.

Powstawanie biofilmów może zachodzić na wszystkich rodzajach powierzchni układów technologicznych w przemyśle mleczarskim, co wiąże się również ze stratami ekonomicznymi. Biofilmy są nie tylko potencjalnym źródłem zanieczyszczeń, ale mogą również zwiększać szybkość korozji, zmniejszać efektywność przenoszenia ciepła i zwiększać opór tarcia płynów. Przy obecnych trendach w kierunku dłuższych serii produkcyjnych, stosowania złożonego sprzętu, automatyzacji zakładów i coraz bardziej rygorystycznych wymagań mikrobiologicznych biofilmy bakteryjne stały się głównym problemem producentów mleka i produktów mleczarskich. W zakładach produkcyjnych biofilmy można podzielić na dwie kategorie – te, które tworzą się na powierzchniach mających bezpośredni kontakt z przepływającym produktem (np. wymiennikach ciepła), oraz te, które tworzą się w ogólnym środowisku przetwarzania mleka.

Biofilmy stwarzają szereg poważnych problemów w przemysłowych operacjach przetwarzania, m.in. w rurociągach, zbiornikach, silosach, systemach udojowych, odpływach, a także w wymiennikach ciepła, zakłócając lub utrudniając pracę urządzeń. Inne miejsca, w których często powstają biofilmy, to membrany filtracyjne, na których osadzają się białka i słabo rozpuszczalne sole mineralne, przyczyniając się do konsolidacji i rozmnażania mikroorganizmów. Tworzenie biofilmu na membranach prowadzi do zmniejszenia ich przepuszczalności, a w konsekwencji do zwiększenia kosztów eksploatacji z powodu konieczności częstego ich czyszczenia lub wymiany.

Zapobieganie tworzeniu się biofilmów w zakładach produkcyjnych powinno obejmować zarówno stosowanie odpowiednich metod mycia i dezynfekcji, jak i sam dobór rozwiązań konstrukcyjnych, które minimalizują możliwość jego tworzenia się. Niezwykle ważny jest dobór maszyn i urządzeń produkcyjnych o wysokich standardach higieny, których powierzchnia nie sprzyja adhezji biofilmu. Najczęściej stosowanym materiałem jest stal nierdzewna, którą można dodatkowo obrabiać za pomocą mechanicznego szlifowania, szczotkowania, docierania oraz polerowania elektrolitycznego lub mechanicznego. 

Równie istotne co zastosowanie odpowiednich rozwiązań konstrukcyjnych jest dobranie skutecznych procedur mycia i dezynfekcji w zakładzie produkcyjnym. Jest to główna strategia kontrolowania zakażeń powierzchni poprzez usuwanie niepożądanych materiałów, w tym mikroorganizmów, osadów, ciał obcych i resztek środków czyszczących. Podstawową metodą mycia instalacji w zakładach produkcyjnych jest mycie w systemie CIP. Jest on zaprojektowany w taki sposób, aby gwarantował eliminację zanieczyszczeń organicznych i nieorganicznych (czyszczenie), dezynfekcję czyszczonej powierzchni z żywych komórek mikroorganizmów (do 99,9%) oraz eliminację pozostałości środków sanitarnych bez konieczności demontażu instalacji. System ten obejmuje kilka podstawowych etapów, w tym:

1. płukanie wstępne zimną wodą w celu usunięcia większych pozostałości produktu;
2. obieg detergentu w celu usunięcia drobnych pozostałości organicznych, np. białek i tłuszczów;
3. płukanie ciepłą wodą w celu pozbycia się detergentu;
4. obieg środka dezynfekującego w celu inaktywacji i zniszczenia wszelkich pozostałych mikroorganizmów i składników nieorganicznych;
5. płukanie zimną wodą w celu pozbycia się detergentu.

Ograniczeniem systemu CIP jest niecałkowite eliminowanie mikroorganizmów na powierzchniach urządzeń, co może powodować tworzenie się biofilmu. Obecnie nie ma jednak jednej znanej techniki, która byłaby w stanie całkowicie zapobiegać lub kontrolować tworzenie się biofilmów w zakładach produkcyjnych. Główną strategią jest regularne czyszczenie i dezynfekcja w celu zapobiegania adhezji nieodwracalnej drobnoustrojów na urządzeniach produkcyjnych. Ważne jest, aby skutecznie usuwać z urządzenia resztki produktów, które mogą zawierać mikroorganizmy lub sprzyjać rozwojowi drobnoustrojów. W tym celu stosuje się nie tylko oddziaływanie mechaniczne (np. turbulencje wody i szorowanie), ale również środki chemiczne. Produkty chemiczne powszechnie stosowane do czyszczenia to środki powierzchniowo czynne lub alkaliczne, które rozpuszczają resztki żywności poprzez obniżanie napięcia powierzchniowego, emulgację tłuszczów i denaturowanie białek. 

Skuteczna procedura czyszczenia musi rozbić lub rozpuścić matrycę EPS związaną z biofilmami, aby środki dezynfekujące mogły uzyskać dostęp do żywych komórek drobnoustrojów. Proces czyszczenia może usunąć 90% lub więcej mikroorganizmów związanych z powierzchnią. Odrywane od powierzchni bakterie mogą jednak ponownie osadzać się w innych miejscach instalacji, po pewnym czasie tworząc biofilm. Dlatego też istotny jest proces dezynfekcji, który polega na zastosowaniu środków przeciwdrobnoustrojowych w celu pozbycia się niekorzystnej mikroflory. Celem dezynfekcji jest zmniejszenie powierzchniowej populacji żywych komórek pozostałych po czyszczeniu do poziomu, który nie wpływa na jakość i bezpieczeństwo wytwarzanej żywności, a także zapobieganie rozwojowi drobnoustrojów na powierzchniach przed wznowieniem produkcji. Środki dezynfekujące muszą być skuteczne, bezpieczne i łatwe w użyciu oraz łatwo zmywalne z powierzchni, nie pozostawiać toksycznych pozostałości, które mogłyby wpłynąć na właściwości produktów spożywczych. Związki chemiczne najczęściej stosowane w procesach dezynfekcji obejmują m.in. związki kwaśne, biocydy na bazie aldehydów, produkty żrące: chlor, nadtlenek wodoru, jod, izotiazolinony, ozon, kwas nadoctowy, związki fenolowe. Skuteczność środków dezynfekujących jest ograniczana przez obecność materiału organicznego, w tym tłuszczów, węglowodanów i białek. Poza tym pH, temperatura, twarda woda, inhibitory chemiczne, stężenie i czas kontaktu są również ważnymi czynnikami wpływającymi na skuteczność tego typu produktów. 

Ze względu na to, że tradycyjne metody usuwania zanieczyszczeń i zwalczania mikroorganizmów nie zawsze są wystarczająco skuteczne w walce z biofilmami, opracowywane i badane są również inne, nowatorskie metody. Należą do nich m.in. stosowanie preparatów enzymatycznych, wykorzystanie bakteriofagów i wykorzystanie ultradźwięków. 

Stosowanie detergentów na bazie enzymów może służyć jako realna możliwość przezwyciężenia problemu biofilmu w przemyśle spożywczym. Specyfika sposobu ich działania stwarza trudność w identyfikacji substancji, które są skuteczne przeciwko wszystkim typom biofilmów. Wykazano jednak potencjalne zastosowanie enzymatycznych środków czyszczących w walce z biofilmami tworzonymi przez mikroorganizmy powszechnie występujące w produktach mleczarskich. Preparaty zawierające kilka różnych enzymów wydają się mieć fundamentalne znaczenie dla skutecznej strategii kontroli biofilmu. Przydatne mogą być enzymy rozkładające białka i polisacharydy. Mimo to stosowanie enzymów do kontroli biofilmu jest ograniczone ze względu na nis-kie ceny stosowanych obecnie środków chemicznych w porównaniu z kosztami preparatów enzymatycznych. Dodatkowo technologie produkcji detergentów na bazie enzymów są w większości chronione patentami.

Bakteriofagi to wszechobecne w przyrodzie wirusy, które infekują bakterie i mogą zapewnić naturalną, wysoce specyficzną i nietoksyczną metodę niszczenia drobnoustrojów zaangażowanych w tworzenie biofilmu. Technologia używania fagów w procesie usuwania biofilmu nie została jeszcze wdrożona do zastosowania przemysłowego, jednak prowadzone są intensywne badania nad ich możliwościami w tym obszarze. Infekcja komórek biofilmu przez fagi jest uwarunkowana ich składem chemicznym oraz czynnikami środowiskowymi, takimi jak temperatura, faza wzrostu, pożywka i stężenie faga. Wpływa to na złożoność wpływu bakteriofagów na biofilm i konieczność dokładnego poznania tego zjawiska.

Ultradźwięki to dobrze znana technika stosowana w różnych procesach przemysłu spożywczego, m.in. w suszeniu, sterylizacji czy ekstrakcji. Badania wskazują, że mogą być również stosowane jako skuteczna metoda usuwania biofilmu. Udokumentowano jednak, że bakterii w przemyśle spożywczym nie można wyeliminować wyłącznie przy użyciu obecnych technologii ultradźwiękowych, a dopiero łącząc je z innymi technikami, np. w połączeniu z zastosowaniem preparatów enzymatycznych czy środków chemicznych. Podobne zależności zaobserwowano również dla innych wyżej wymienionych nowatorskich technik walki z biofilmem. Wskazuje się na największą skuteczność, gdy są one stosowane z innymi, również tradycyjnymi metodami, np. różnego rodzaju detergentami i środkami dezynfekującymi. 

Badania nad biofilmami zyskały zainteresowanie w przemyśle mleczarskim ze względu na zapotrzebowanie konsumentów na produkty wysokiej jakości, bezpieczne i o wydłużonej trwałości. Ponadto zaobserwowano wpływ ich powstawania na straty ekonomiczne związane nie tylko z jakością produktów spożywczych, ale również ze stanem technicznym maszyn i urządzeń produkcyjnych. Mikroorganizmy obecne w biofilmach katalizują reakcje chemiczne i biologiczne powodujące korozję metali w rurociągach i zbiornikach oraz mogą zmniejszać skuteczność wymiany ciepła. Mimo że prowadzone są badania nad metodami umożliwiającymi eliminację biofilmu ze środowiska produkcyjnego, nie określono jednej, uniwersalnej metody, która umożliwi pozbycie się problemu. Istnieje potrzeba poszukiwania innowacyjnych rozwiązań, które będą wykazywały wysoką skuteczność w walce z biofilmem przy zachowaniu stosunkowo niskich kosztów podejmowanych działań. 

Literatura:

1. Mogha K. i wsp., Biofilm – A threat to dairy industry, „Indian Journal of Dairy Science” 2014, nr 67(6), s. 459-466.
2. Parul S. i wsp., Biofilm: An Alarming Niche in Dairy Industry, „International Journal of Livestock Research” 2019, nr 9(4), s. 11-24.
3. Ryabtseva S.A. i wsp., Modelling formation and removal of biofilms in secondary dairy raw materials, „Foods and Raw Materials” 2021, nr 9(1), s. 59-69.
4. Simões M. i wsp., A review of current and emergent biofilm control strategies, „LWT – Food Science and Technology” 2010, nr 43, s. 573-583.
5. Srey S. i wsp., Biofilm formation in food industries: A food safety concern, „Food Control” 2013, nr 31, s. 572-585.
6. Vlakova H. i wsp., Biofilms and Hygiene on Dairy Farms and in the Dairy Industry: Sanitation Chemical Products and their Effectiveness on Biofilms – a Review, „Czech Journal of Food Sciences” 2008, nr 26(5), s. 309-323.