Fermentacja propionowa: Wykorzystanie bakterii fermentacji propionowej

Bakterie z rodzaju Propionibacterium są Gram-dodatnimi, nieprzetrwalnikującymi, niewykazującymi zdolności do ruchu, beztlenowymi lub względnie beztlenowymi pałeczkami, które w obrazie mikroskopowym są widoczne najczęściej jako pojedyncze komórki, czasami w skupiskach lub krótkich łańcuszkach. Po raz pierwszy zostały wyizolowane z sera Emmental i zbadane przez duńskiego chemika i bakteriologa Sigurda Orla-Jensena oraz szwajcarskiego biochemika Eduarda von Freudenreich w roku 1906 r. (dwa charakterystyczne gatunki bakterii propionowych – P. freudenreichii oraz P. jensenii – upamiętniają nazwiska tych dwóch badaczy). W 1928 r. amerykański mikrobiolog pochodzenia holenderskiego Cornelis Bernardus van Niel zaklasyfikował bakterie mające zdolność do syntezy kwasu propionowego do oddzielnego, nowego rodzaju Propionibacterium. Aktualna systematyka obejmuje 6 gatunków bakterii z rodzaju Propionibacterium. Większość Propionibacterium rośnie w zakresie temperatur 20-45°C (optimum 30-37°C), ale zdarzają się rosnące w temperaturze poniżej 10°C. Optymalne pH dla wzrostu tych bakterii mieści się w zakresie 6,5-7,0 (w pH poniżej 4,6 już nie rosną wcale). Wykazują zmienną zdolność do redukcji azotanów, słabą aktywność proteolityczną (tworzą wewnątrzkomórkowe peptydazy) oraz brak lub słabą aktywność lipolityczną. Wykazują wrażliwość na NaCl (dlatego w serach typu szwajcarskiego, w których produkcji są wykorzystywane, zawartość soli jest niska).

Propionibacterium wyróżniają się dużą heterogennością pod względem właściwości biologicznych, a także cech taksonomicznych. Umownie bakterie propionowe dzieli się na dwie grupy: 1) „klasyczne” lub „mleczne” (P. freudenreichii i P. acidipropionici, które nie wykazują negatywnych działań niepożądanych, szeroko stosowane w przemyśle spożywczym i farmaceutycznym), 2) „skórne” lub „acnes” (w tym dobrze znany P. acnes, które mogą działać jako patogeny oportunistyczne).

Klasyczne Propionibacterium wyraźnie różnią się od gatunków „skórnych”. „Skórne” Propionibacterium nie są tak aktywne pod względem fermentacyjnym, jak klasyczne bakterie propionowe. Klasyczne Propionibacterium występują w materiale roślinnym, w surowym mleku i serach (w serach typu szwajcarskiego, np. serze Emmental, w trakcie dojrzewania masy serowej populacja bakterii z gatunku P. freudenreichii może sięgać 109 jtk/g), kiszonkach, glebie, na skórze i błonach śluzowych, a także w przewodzie pokarmowym zwierząt (u przeżuwaczy, np. u bydła – w żwaczu). Natomiast skórne Propionibacterium zaliczają się do egzo- i endogennej flory bakteryjnej zasiedlającej skórę człowieka, szczególnie twarzy i jej okolic, oraz błony śluzowe jamy ustnej i przewodu pokarmowego. Klasyczne bakterie propionowe mają nadany status GRAS (ogólnie uznane za bezpieczne) zgodnie z długą i udokumentowaną historią bezpiecznego stosowania są wykorzystywane do żywności. Ponadto P. freudenreichii i P. acidipropionici są wymienione na liście QPS (Domniemanie Bezpieczeństwa, Qualified Presumption of Safety) opracowanej przez Europejski Urząd ds. Bezpieczeństwa Żywności (EFSA). Klasyczne Propionibacterium wytwarzają wewnątrzkomórkowe lipazy, wykazujące aktywność w stosunku do triacyloglicerydów mleka, a także enzymy proteolityczne. Wiele danych sugeruje również właściwości probiotyczne niektórych szczepów „mlecznych” bakterii propionowych, a wybranym ich metabolitom (np. kwas 1,4-dihydroksy-2-naftoesowy, czyli DHNA) – nawet właściwości prebiotyczne. Do identyfikacji klasycznych bakterii propionowych i ich różnicowania do poziomu rodzaju, gatunku i podgatunku wykorzystywane są metody fenotypowe (analiza cech biochemicznych), genotypowe i instrumentalne.

Klasyczne bakterie propionowe są drobnoustrojami, które od stuleci mają swoje zastosowanie w przemyśle spożywczym i żywieniu zwierząt. To na nich skupimy się w niniejszym artykule. Głównym metabolitem wytwarzanym przez klasyczne bakterie propionowe jest kwas propionowy, powstający na drodze fermentacji propionowej (zdolność do fermentacji laktozy przez klasyczne Propionibacterium jest szczepozależna). Pozostałymi produktami tej fermentacji są m.in. kwas octowy, kwas bursztynowy i dwutlenek węgla. Bakterie z rodzaju Propionibacterium są zdolne do syntezy wielu innych cennych związków o szerokim zastosowaniu, m.in.: witamin z grupy B (w tym witaminy B12), trehalozy i bakteriocyn.

Wykorzystanie klasycznych Propionibacterium w mleczarstwie

Bakterie z rodzaju Propionibacterium, zwłaszcza P. freudenreichii, znalazły szerokie zastosowanie w przemyśle serowarskim, szczególnie w produkcji twardych serów podpuszczkowych typu szwajcarskiego (zalicza się do nich m.in. ser szwajcarski Emmental, holenderski Leerdammer, francuski Comté, polskie Tylżycki i Królewski) – razem z bakteriami kwasu mlekowego, których obecność sprzyja rozwojowi Propionibacterium. Rola tych bakterii w produkcji serów typu szwajcarskiego polega na przeprowadzeniu fermentacji mleczanów i asparaginianu do kwasów propionowego, bursztynowego i octowego (uważane za główne związki smakowe), kwasów 2-metylobutanowego i izowalerianowego (lotnych, a więc wpływających na zapach serów), oraz z wydzieleniem CO2, co daje specyficzne oczkowanie (w serze szwajcarskim oczka są liczne i o dużej średnicy), smak, aromat i utrwalenie produktu końcowego (to m.in. kwasy organiczne pełnią funkcję naturalnych substancji konserwujących). Bakterie propionowe przyczyniają się także do powstawania charakterystycznych cech organoleptycznych serów typu szwajcarskiego, przede wszystkim dzięki uwalnianiu znacznych ilości proliny (aminopeptydazy Propionibacterium wykazują swoistą aktywność wobec reszty proliny), która nadaje serom słodkawy, orzechowy smak i zapach. Zdolność i intensywność metabolizmu asparaginianu u P. freudenreichii są szczepozależne – wysoki metabolizm asparaginianu prowadzi do wydzielania znaczniejszych ilości CO2. To właśnie katabolizm asparaginianu jest wiązany z wadami struktury miąższu serów typu szwajcarskiego (powstawanie szczelin i pęknięć). Bakterie propionowe okazują ponadto dużą zdolność do degradacji niektórych aminokwasów, szczególnie kwasu asparaginowego, alaniny, seryny i glicyny, dzięki czemu aktywnie uczestniczą w procesie dojrzewania serów. Dla smaku sera ważne są również wolne kwasy tłuszczowe, wiadomo jednak że aktywność lipolityczna Propionibacterium podczas dojrzewania sera jest szczepozależna.

W przemyśle mleczarskim bakterie propionowe wykorzystywane są również jako składnik mikroflory kultur starterowych opracowanych do produkcji mlecznych napojów fermentowanych i innych przetworów mleczarskich. To wykorzystanie bakterii propionowych, wykraczające poza serowarstwo, wiąże się ze zdolnością tych mikroorganizmów do tworzenia metabolitów o działaniu fungistatycznym oraz antybakteryjnym, a także biosyntezy witamin z grupy B. Propionibacterium wykazują wysoką przeżywalność w środowiskach o niskiej wartości pH lub wysokich stężeniach soli żółciowych. Mają zdolność do adherencji do błony śluzowej i komórek nabłonkowych jelit. Istnieje wiele doniesień naukowych potwierdzających ich korzystny wpływ na fizjologię i zdrowie „gospodarza”, również człowieka. Podstawowym mechanizmem działania bakterii propionowych jest wytwarzanie kwasu propionowego i tym samym modulacja składu mikroflory jelitowej. Ich obecność w układzie pokarmowym powoduje redukcję populacji mikroflory patogennej, a w kombinacji z innymi szczepami probiotycznymi mogą hamować adhezję bakterii z gatunku Helicobacter pylori do nabłonka jelitowego. Bakterie z rodzaju Propionibacterium syntetyzują również kwas 5-aminolewulinowy (ALA), który znalazł zastosowanie w terapii nowotworowej. Niektóre szczepy bakterii z rodzaju Propionibacterium mogą wykazywać aktywność przeciwmutagenną poprzez redukcję aktywności enzymów prokancerogennych (np. -glukozydazy) lub inaktywację egzogennych mutagenów (np. aflatoksyn, N-metylo-N-nitro-N-nitrozoguanidyny czy 9-aminoakrydyny). Przypisuje im się także działanie zapobiegawcze w przypadku nowotworów układu pokarmowego (niektóre szczepy z gatunków P. freudenreichii i P. acidipropionici wywołują apoptozę komórek raka jelita grubego). Za przeciwnowotworowe właściwości bakterii propionowych odpowiedzialne są najprawdopodobniej krótkołańcuchowe kwasy tłuszczowe, a szczególnie kwas propionowy. Propionibacterium mogą także wywierać wpływ immunomodulacyjny i przeciwzapalny. Oczywiście, nie można pominąć zdolności tych bakterii do wytwarzania -galaktozydazy, enzymu odpowiedzialnego za rozkład laktozy (co ciekawsze, enzym ten pozostaje aktywny nawet po zastosowaniu wysokich temperatur w procesie produkcji serów typu szwajcarskiego). Ta aktywność może być wykorzystana do łagodzenia dolegliwości u niektórych ludzi wynikających z nietolerancji laktozy. Ponadto, doniesienia naukowe potwierdzają, że badane szczepy należące do klasycznych bakterii propionowych spożywane przez człowieka mogą wpływać korzystnie na jego zdrowie. Bezpieczeństwo stosowania klasycznych bakterii propionowych jest oczywiste, ze względu na fakt spożywania serów typu szwajcarskiego. We Francji w ciągu roku jedna osoba spożywa średnio 4 kg sera Emmental, gdzie zawartość komórek Propionibacterium spp. wynosi blisko 109 bakterii na 1 g produktu. Dodatkowo, wybrane gatunki najczęściej stosowane w przemyśle rolno-spożywczym posiadają certyfikaty bezpieczeństwa przyznawane przez odpowiednio do tego uprawnione instytucje (FDA i EFSA).

Jak wspomniano wcześniej, niektóre metabolity bakterii propionowych mają już udokumentowane uznawane właściwości prebiotyczne. Bakterie z gatunku P. freudenreichii subsp. shermanii są zdolne do wytwarzania czynnika bifidogennego (BGS, bifidogenic growth stimulator), który wzmaga rozwój Bifidobacterium w przewodzie pokarmowym ludzi i zwierząt (a tym samym regulację składu mikroflory jelitowej), a także namnożenia się w produktach spożywczych. Do takich prebiotycznych metabolitów Propionibacterium zalicza się m.in. DHNA (kwas 1,4-dihydroksy-2-naftoesowy) oraz ACNQ (2-amino-3-karboksy-1,4-naftochinon). DHNA jest prekursorem do biosyntezy witaminy K2 (menachinonu). Ponadto, DHNA może modulować udział Lactobacillus i Enterobacteriacea w mikroflorze jelitowej w przypadku zapalenia okrężnicy, a także indukować ekspresję przeciwbakteryjnych białek z rodziny lektyn. Badania sugerują, że ACNQ nawet przy niskim stężeniu zwiększa selektywne wykorzystanie oligosacharydów przez bifidobakterie. Zarówno ACNQ, jak i DHNA pełnią funkcję mediatorów pośredniczących w procesach regeneracji NADP u bakterii z rodzaju Bifidobacterium. ACNQ i DHNA mają również potencjał jako związki przeciwzapalne (tłumienie cytokin prozapalnych pochodzących z makrofagów) i przeciwalergiczne. Wpływ bifidogenny obserwuje się przy podawaniu bezkomórkowego supernatantu hodowli P. freudenreichii, który został nazwany bifidogennym stymulatorem wzrostu, co potwierdza rolę wydzielanych składników o bifidogennym działaniu. BGS badano na ludziach (w dużych dawkach, do 45 tabletek dziennie), bez zauważalnego działania niepożądanego, wykazując potencjał i bezpieczeństwo stosowania tych składników jako prebiotyków.

Oczywiście, produkty aktywności metabolicznej bakterii propionowych tj. bakteriocyny, kwasy organiczne, diacetyl i inne niskocząsteczkowe metabolity mogą przyczyniać się do redukcji wzrostu mikroorganizmów niepożądanych (głównie zahamowania wzrostu drożdży i pleśni), a nawet niekiedy eliminacji ich populacji, a tym samym wpływać na trwałość i bezpieczeństwo żywności. Wybrane szczepy z rodzaju Propionibacterium już od lat są wykorzystywane w mleczarstwie jako tzw. kultury ochronne (potencjał właściwościach przeciwdrobnoustrojowych szczepów bakterii z rodzaju Propionibacterium znajduje wykorzystanie również w przemyśle paszowym, a branże medyczna i kosmetyczna są nimi żywo zainteresowane). Wiele badań dowodzi, że bakterie propionowe wykazują właściwości przeciwdrobnoustrojowe w stosunku do wielu grup mikroorganizmów, w tym bakterii Gram-ujemnych oraz niektórych pleśni i drożdży.

Najważniejszym metabolitem Propionibacterium wykazującym aktywność przeciwdrobnoustrojową jest kwas propionowy. Jest on, tak samo jak jego sole (propioniany), znanym konserwantem w stosunku do pleśni. Należy zauważyć, że korzystne właściwości tego kwasu na tym się nie kończą. Udowodniono, że kwas propionowy ma właściwości immunostymulujące organizm do walki z komórkami raka żołądka i okrężnicy (może indukować apoptozę w komórkach rakowych), wpływa na zwiększenie absorpcji wapnia z jelit do organizmu człowieka, może również hamować syntezę cholesterolu i kwasów tłuszczowych. Przeciwdrobnoustrojowe działanie wykazuje nie tylko kwas propionowy, ale także inne kwasy organiczne, w tym kwasy octowy, bursztynowy, mlekowy, 2-pirolidon-5-karboksylowy, 3-fenylolowy, hydroksyfenylomleczny i 3-fenylolaktowy. Ponadto, jak już wspomniano, Propionibacterium wytwarzają szereg bakteriocyn (peptydów lub białek) o aktywności bójczej lub statycznej wobec innych bakterii propionowych (spokrewnionych z producentem bakteriocyny lub skórnych Propionibacterium), bakterii kwasu mlekowego (tzw. niestarterowych bakterii fermentacji mlekowej lub tych odpowiadających za przekwaszenie produktów fermentowanych), innych bakterii Gram-dodatnich (w tym powstawanie lub kiełkowanie przetrwalników bakterii z rodzaju Clostridium), bakterii Gram-ujemnych (w tym patogennych dla człowieka), drożdży i pleśni. Wiele tych bakteriocyn jest ciepłostabilnych, co może potencjalnie poszerzać możliwości ich wykorzystania w mleczarstwie.

Do ciekawych metabolitów bakterii z rodzaju Propionibacterium zaliczyć należy również trehalozę (jest to dwucukier złożony z dwóch cząsteczek glukozy), która okazuje się świetną substancją bioochronną dla żywych komórek w stresie środowiskowym. Udowodniono, że bakterie z gatunku P. freudenreichii są w stanie magazynować znaczne ilości trehalozy w warunkach stresowych. Wiadomo już, że do syntezy trehalozy najlepszym źródłem węgla jest laktoza, co może otwierać potencjał dla branży mleczarskiej.

Bakterie propionowe posiadają aktywny enzym izomerazę kwasu linolowego, pozwalający im na syntezę sprzężonych dienów kwasu linolowego (CLA) o powszechnie już znanych właściwościach prozdrowotnych. Aktywność biologiczna związana z cis-9,trans-11 CLA (c9,t11 CLA) i izomerami trans-10,cis-12 CLA (t10,c12 CLA) obejmuje właściwości przeciwnowotworowe, przeciwmiażdżycowe, przeciwcukrzycowe i immunostymulacyjne, a także pozytywny wpływ na regenerację kości.

Podsumowanie

Klasyczne bakterie propionowe są uznanymi sprzymierzeńcami człowieka. Są dzięki temu stosowane od lat w procesach biosyntezy związków istotnych dla człowieka (np. witamin z grupy B, kwasu propionowego, trehalozy, CLA, czynników bifidogennych czy bakteriocyn) jak również do fermentacji i bioutrwalania żywności. Badania dowodzą, że te mikroorganizmy mają dodatkowe właściwości prozdrowotne, co poszerza możliwość ich wykorzystania do opracowywania produktów o dodanej wartości żywieniowej czy zdrowotnej.