Mikrobiologia: Zagrożenia mikrobiologiczne – gronkowiec złocisty

Spośród mikroflory występującej w żywności wyróżnia się drobnoustroje saprofityczne (które nie są chorobotwórcze dla człowieka, ale mogą na przykład powodować zepsucie mikrobiologiczne produktów) oraz drobnoustroje chorobotwórcze (które stanowią zagrożenie biologiczne dla człowieka, a ich występowanie wynika z różnych przyczyn). Z punktu widzenia bezpieczeństwa żywności, jak również jej trwałości i jakości, w pierwszej kolejności istotne są drobnoustroje chorobotwórcze. Ich źródłem w produktach spożywczych mogą być surowce (są to najczęściej bakterie przetrwalnikujące lub ciepłooporne, które w warunkach wysokiej higieny produkcji mogą stanowić jedyną mikroflorę produktów spożywczych, bowiem w produkcie końcowym tylko drobnoustroje, które pochodzą z surowca i które przeżyły cały proces produkcji mogą pozostać) i/lub proces produkcji i otoczenie produkcyjne (takie jak powierzchnia maszyn i urządzeń, zbiorniki i tanki, różne przewody, powietrze, woda, dodatki technologiczne oraz powierzchnia opakowań jednostkowych). Zależnie od rodzaju procesu i warunków higienicznych podczas produkcji może dochodzić nie tylko do zanieczyszczania nowymi drobnoustrojami, ale również do rozwoju już obecnych drobnoustrojów, czemu szczególnie sprzyja międzyoperacyjne przetrzymywanie półproduktów. W przypadku mikroflory produktów poddawanych zabiegom termicznym, takim jak pasteryzacja lub sterylizacja, bardzo istotne są te źródła wynikające z procesu produkcji i otoczenia produkcyjnego, bowiem tymi drogami do żywności mogą dostać się nie tylko bakterie przetrwalnikujące lub ciepłooporne, ale również wszelkiego rodzaju wegetatywne formy mikroorganizmów (żywe komórki). Okazuje się, że termiczna inaktywacja wegetatywnych form niektórych mikroorganizmów nie gwarantuje bezpieczeństwa produktów żywnościowych, jeśli zdążą one wcześniej wytworzyć toksyny niebezpieczne dla zdrowia lub życia człowieka. Takimi mikroorganizmami są Staphylococcus aureus.

Staphylococcus aureus są to bakterie widoczne w obrazie mikroskopowym jako dwoinki, krótkie łańcuszki lub skupiska przypominające winogrona (z języka greckiego „staphyle” oznacza kiść winogron, zaś „coccus” oznacza ziarno). Komórki gronkowców są kuliste, zwykle o średnicy od 0,8 do 1 mikrometra. Są to tlenowe lub względnie beztlenowe bakterie mezofilne, Gram-dodatnie i nieprzetrwalnikujące. Szczepy S. aureus mogą być koagulazo-ujemne lub koagulazo-dodatnie. Temperatura wzrostu komórek S. aureus ogólnie mieści się w zakresie od 7°C do 48°C, przy czym optymalna temperatura wzrostu wynosi 35-37°C. Zakres pH wzrostu wynosi od 4,5 do 9,3, zaś optymalny od 7,0 do 7,5. Komórki S. aureus są oporne na wysokie ciśnienia.

S. aureus są zdolne do wytwarzania toksyn w szerokim zakresie temperatury od 10°C do ok. 45°C, z optimum w przedziale 34-40°C.

Są wszechobecne i niemożliwe do wyeliminowania ze środowiska. Można je znaleźć w glebie, kurzu, wodzie i powietrzu oraz na przedmiotach i powierzchniach codziennego użytku. Mogą żyć na błonach śluzowych, włosach i skórze ludzi i zwierząt (szacuje się, że około 20-50% osobników może być stałym lub przejściowym nosicielem gronkowców) oraz w środowisku ich bytowania. Wiele gatunków i podgatunków bakterii z rodzaju Staphylococcus można potencjalnie znaleźć w żywności z powodu zanieczyszczenia środowiska, ludzi i zwierząt. Niektóre szczepy S. aureus mogą zasiedlać urządzenia i środowisko produkcyjne zakładu (biofilmy), co jest niezwykle istotne w produkcji żywności.

Epidemiologia Staphylococcus aureus

S. aureus jest czynnikiem etiologicznym związanym z ustrojowymi zakażeniami gronkowcem lub gronkowcowym zatruciem pokarmowym. Zakażenia gronkowcem są wywoływane przez kilka różnych rodzajów bakterii gronkowcowych, w tym: oporne na metycylinę S. aureus (MRSA), wrażliwe na metycylinę S. aureus (MSSA), średniooporne na wankomycynę S. aureus (VISA) oraz oporne na wankomycynę S. aureus (VRSA). Mogą one powodować: bakteriemie lub posocznicę (gdy bakterie dostaną się do krwiobiegu), zapalenie płuc, zapalenie wsierdzia, zapalenie kości lub szpiku.

Wiele gatunków S. aureus, zarówno szczepy koagulazo-ujemne, jak i koagulazo-dodatnie, wykazują zdolność do wytwarzania enterotoksyn powodujących gronkowcowe zatrucie pokarmowe. Enterotoksyny gronkowcowe (SE) są białkami jednołańcuchowymi, o masie cząsteczkowej od 26 do 35 kDa, rozpuszczalnymi w wodzie i ciepłostabilnymi. Co równie ważne, są także oporne na enzymy proteolityczne, co pozwala im na tranzyt przez część żołądkowo-jelitową przewodu pokarmowego w stanie nienaruszonym. Enterotoksyny gronkowcowe są syntetyzowane w fazie logarytmicznego wzrostu S. aureus. Wyróżnia się ponad 10 serotypów enterotoksyn S. aureus, wszystkie wykazują aktywność wymiotną. Zdolność do syntezy toksyn u S. aureus jest kodowana przez geny zlokalizowane na ruchomych elementach genetycznych, co oznacza możliwość ich przekazywania spokrewnionym szczepom lub gatunkom bakterii na drodze horyzontalnego transferu. Wszystkie znane enterotoksyny gronkowcowe są zaliczane do tzw. superantygenów, czyli toksyn immunomodulujących, nieswoiście stymulujących układ immunologiczny aktywując dużą liczbę limfocytów T, co wywołuje masowe wytwarzanie cytokin i wstrząs zagrażający życiu. Wiadomo jednak, że za gronkowcowe zatrucia pokarmowe najczęściej odpowiedzialne są enterotoksyny A (ok. 75% przypadków) i D, a w mniejszym stopniu B, C, E, H i inne immunologicznie różne enterotoksyny. To zróżnicowanie zjadliwości SE wynika m.in. z tego, że są one wytwarzane w różnych warunkach środowiskowych. Jest to niezwykle istotne, że czynnikiem patogennym nie są same żywe komórki bakteryjne, ale ich ciepłooporne metabolity. Termiczna inaktywacja komórek nie oznacza eliminacji aktywności biologicznej uprzednio powstałych enterotoksyn gronkowcowych.

Dawka zatrucia SE to zwykle ok. 0,5-1 mikrograma (choć u osób bardzo wrażliwych spożycie już 0,1-0,2 mikrograma SE może wywołać zatrucie), a tyle toksyn jest wytwarzanych, gdy populacja komórek S. aureus przekracza 100 000 w 1 g żywności (w przypadku niektórych serotypów SE ich synteza zaczyna się już we wczesnych fazach wzrostu populacji bakteryjnej). O ilości wytworzonej toksyny decydują takie czynniki jak np.: wartość pH środowiska (> 5 i  0,86), zasolenie (do 12%). Już kilka nanogramów SE w 1 ml może aktywować do 50% wszystkich limfocytów T w organizmie osobnika zainfekowanego toksynotwórczym S. aureus. Po spożyciu SE szybko (w ciągu od 1 do 7 godzin) mogą pojawić się objawy, które zwykle obejmują nudności, skurcze brzucha, wymioty i biegunkę oraz ogólne wyczerpanie organizmu. W cięższych przypadkach mogą wystąpić: odwodnienie, ból i zawroty głowy, skurcze mięśni oraz przejściowe zmiany ciśnienia krwi i tętna, podwyższona ciepłota ciała lub gorączka, dreszcze i pocenie się. Objawy trwają zwykle od kilku godzin do jednego dnia i samoczynnie ustępują (tylko w niektórych przypadkach objawy zmuszają do hospitalizacji pacjenta). Śmiertelność z powodu gronkowcowego zatrucia pokarmowego jest niezwykle rzadka, odnotowywano jednak zgony wśród osób starszych, niemowląt i osób poważnie osłabionych. Szacuje się, że epizody gronkowcowego zatrucia pokarmowego są sporadyczne, chociaż można przypuszczać, że podobnie jak w przypadku innych zatruć pokarmowych, nie wszystkie zdarzenia zatrucia powodowane przez S. aureus są identyfikowane i rejestrowane w sanitarnych bazach danych.

Występowanie i aktywność S. aureus w żywności

Najczęstszym żywnościowym środowiskiem występowania S. aureus są surowce i produkty pochodzenia zwierzęcego lub surowce i produkty mające kontakt z ludźmi będącymi nosicielami komórek gronkowca (kontakt bezpośredni lub poprzez kaszel i kichanie podczas infekcji dróg oddechowych). Najczęściej takimi surowcami i produktami są mięso i produkty mięsne; drób i produkty jajeczne, mleko surowe i przetwory z niego otrzymywane, sałatki i pasty kanapkowe (np. zawierające jajka, mięso tuńczyka, kurczaka, ziemniaki lub makaron), wyroby cukiernicze nadziewane kremem. Również produkty dłuższy czas przetrzymywane w temperaturze chłodniczej lub nawet w temperaturze nieco powyżej niej (np. w temperaturze > 7°C), a także niewłaściwie przygotowywane (w temperaturze

Jak wspomniano wcześniej, wegetatywne komórki S. aureus nie są oporne na ogrzewanie, giną podczas obróbki w temperaturze ok. 65°C. Natomiast enterotoksyny gronkowcowe mogą zachować aktywność biologiczną nawet po takich procesach jak pasteryzacja, gotowanie, wędzenie, pieczenie lub suszenie. Komórki wegetatywne S. aureus są inaktywowane już w temperaturze pasteryzacji mleka lub gotowania produktów mięsnych. Są również niszczone innymi metodami stosowanymi do utrwalania żywności, np. napromieniowywaniem lub wysokim ciśnieniem (skuteczność ostatniej z wymienionych metod może być podwyższona przez połączenia z nizyną). S. aureus są oporne na substancje konserwujące, a nawet mogą nabywać selektywną oporność ze względu na tolerancję na podwyższone stężenia NaCl (stąd wynika możliwość obecności żywych komórek gronkowca złocistego w solance) oraz azotynów. S. aureus są w stanie rozwijać się w opakowaniach próżniowych lub w modyfikowanej atmosferze (chociaż synteza enterotoksyn jest zahamowana).

Dane dotyczące występowania i rozwoju S. aureus, a także zdolności tych bakterii do wytwarzania SE, w żywności nie są zbyt bogate. Większość doświadczeń dotyczy wytwarzania wybranych enterotoksyn przez S. aureus w podłożach mikrobiologicznych, natomiast niewiele jest badań na żywności (spośród produktów mleczarskich głównie są to mleko i niektóre rodzaje serów). W warunkach doświadczalnych znacznie łatwiej prowadzi się badania na układach modelowych, a okazuje się, że w przypadku gronkowca złocistego wyniki badań na układach modelowych nie muszą przenosić się wprost na rezultaty obserwowane w warunkach rzeczywistych. Wynika to z bardzo wielu czynników, w tym stopnia złożoności matrycy żywnościowej, a także jej wpływu na ekspresję genów kodujących syntezę enterotoksyn gronkowcowych. Udowodniono już, że wzrost S. aureus w mleku indukuje ekspresję innych genów niż na przykład wzrost w podłożu mikrobiologicznym, zaś termostabilność niektórych enterotoksyn jest większa w żywności niż w pożywkach mikrobiologicznych. Badania sugerują, że w przypadku niektórych serotypów SE mleko nie jest korzystnym środowiskiem dla ich wytworzenia przez S. aureus, zaś w przypadku innych serotypów – może być środowiskiem nawet lepszym lub porównywalnym.

Wiadomo że gronkowiec złocisty jest patogenem wywołującym mastitis u krów, najczęstszym i najtrudniejszym do zwalczania. Zapalenia wymion powodowane przez S. aureus przebiegają zwykle bez objawów klinicznych i przewlekle. Korzystne warunki wzrostu komórek S. aureus, a także syntezy SE, w mleku powodują, że czynniki te są znajdywane w przetworach mleczarskich, szczególnie tych otrzymywanych z mleka niepasteryzowanego. Dane RASFF od wielu lat dowodzą, że mleko surowe i przetwory z mleka surowego, szczególnie sery świeże lub miękkie, są potwierdzanym źródłem S. aureus, chociaż nie dominują jako źródło występowania w rejestrach RASFF. Według raportów EFSA enterotoksyny gronkowcowe są odpowiedzialne za ok. połowę zidentyfikowanych epidemii zatruć pokarmowych, które stanowią mniej niż 10% zgłoszonych epidemii zatruć pokarmowych. Być może to jest uzasadnieniem, dlaczego w danych RASFF alerty dotyczące obecności S. aureus lub ich toksyn w mleku i przetworach mlecznych występują tak sporadycznie. W 2018 r. we francuskim miękkim serze wyprodukowanym z mleka surowego wykryto aż 47 tys. komórek gronkowca złocistego w 1 g produktu. W tym samym roku wykryto komórki S. aureus w odżywkach dla dzieci, wyprodukowanych w Niderlandach. Sześć lat wcześniej Hiszpanie wykryli obecność S. aureus w serze rzemieślniczym (51 tys. komórek w 1 g produktu), zaś Cypryjczycy w tartym parmezanie (2,7-6,7 tys. komórek w 1 g). W 2009 r. we Francji odnotowano aż 6 lokalnych gronkowcowych zatruć pokarmowych, których źródłem były sery wyprodukowane z mleka niepasteryzowanego. W serach wykryto obecność koagulazo-dodatnich gronkowców na poziomie powyżej 1,5x105 jtk/g. Dla porównania, Brytyjczycy w 2003 r. odnotowali w świeżym serze „Santa Eugenia” żywe komórki S. aureus na poziomie aż 4,3 x104 jtk/g. Wcześniej przypadki zatruć wywołanych przez S. aureus odnotowywano rzadko. Obecnie ponownie obserwuje się tendencję spadkową liczby przypadków intoksykacji gronkowcowych. Należy jednak pamiętać, że ważna jest obecność toksyn, a nie samych żywych komórek gronkowców. Dlatego, w Rozporządzeniu Komisji (WE) nr 2073/2005 z dnia 15 listopada 2005 r. w sprawie kryteriów mikrobiologicznych dotyczących środków spożywczych do kryterium higieny procesu zaliczono obecność S. aureus, natomiast do kryterium bezpieczeństwa żywności – obecność enterotoksyn gronkowcowych. Aby spełnić kryterium bezpieczeństwa żywności sery, mleko w proszku i serwatka w proszku nie mogą zawierać enterotoksyn gronkowcowych w 25 g. Badanie na obecność enterotoksyn gronkowcowych powinno być wykonane w przypadku wykrycia na etapie weryfikacji kryterium higieny procesu gronkowców koagulazo-dodatnich w liczbie powyżej 105 jtk/g (uznaje się, że dopiero powyżej tej populacji komórek gronkowca złocistego powstaje odpowiednia ilość enterotoksyn, która może wywołać zatrucie pokarmowe).

Wedle Rozporządzenia 2073/2005 jakość badanych prób przetworów mleczarskich jest zadowalająca, jeśli we wszystkich 25-gramowych próbkach nie wykryto enterotoksyn, zaś jakość jest niezadowalająca, jeśli obecność enterotoksyn wykryto chociażby w jednej próbce. Dla serów wyprodukowanych z mleka surowego kryterium higieny procesu dopuszcza w 2 z 5 badanych próbek obecność komórek gronkowców koagulazo-dodatnich na poziomie między 104 i 105 jtk/g, a w pozostałych próbkach nieobecność w populacji większej niż 104 jtk/g. W żadnej z badanych 5 próbek serów wyprodukowanych z mleka populacja nie może być większa niż 105 jtk/g. Znacznie ostrzejsze kryterium higieny procesu jest ustalone dla serów wyprodukowanych z mleka poddanego obróbce termicznej w temperaturze niższej niż pasteryzacja i dla serów dojrzewających, wyprodukowanych z mleka lub serwatki, poddanych pasteryzacji lub obróbce cieplnej w wyższej temperaturze. W ich przypadku w 2 z 5 badanych próbek obecność komórek gronkowców koagulazo-dodatnich na poziomie między 100 a 1000 jtk/g; w pozostałych próbkach nieobecność w populacji większej niż 100 jtk/g. W żadnej z badanych 5 próbek populacja nie może być większa niż 1000 jtk/g. Z kolei dla serów niedojrzewających (świeżych) wyprodukowanych z mleka lub serwatki poddanych pasteryzacji lub obróbce cieplnej w wyższej temperaturze, mleka w proszku i serwatki w proszku kryterium higieny procesu przewiduje, że w 2 z 5 badanych próbek wykryto obecność komórek gronkowców koagulazo-dodatnich dopuszczona jest na poziomie między 10 a 100 jtk/g; w pozostałych próbkach nieobecność w populacji większej niż 10 jtk/g. W żadnej z badanych 5 próbek populacja nie może być większa niż 100 jtk/g.