Bakterie mlekowe: Genetyczne udoskonalanie bakterii fermentacji mlekowej

dr hab. Małgorzata Ziarno, prof. SGGW, SGGW Warszawadr inż. Dorota Zaręba, ZSG Warszawa
Forum Mleczarskie Biznes 3/2019 (37)
© fm

Od tysięcy lat bakterie fermentacji mlekowej są wykorzystywane (początkowo nieświadomie, a potem już świadomie i w sposób kontrolowany) przez ludzkość, do bioutrwalania żywności i produkcji wyrobów o nowych, cennych, niepowtarzalnych cechach żywieniowych i sensorycznych. Od kilkudziesięciu lat duże znaczenie mają również szczepy probiotyczne bakterii fermentacji mlekowej, powszechnie uznawane za korzystne dla zdrowia człowieka, ze względu na wpływ, jaki bezpośrednio i pośrednio wywierają na układ pokarmowy, a szczególnie stan jelita grubego. Mikroorganizmy te należą do silnie zróżnicowanej grupy drobnoustrojów, wśród której różne szczepy mogą charakteryzować się całkowicie odmiennymi cechami. Zwiększające się oczekiwania producentów żywności wobec oferowanych kultur bakterii fermentacji mlekowej generują intensywny rozwój badań nad poszukiwaniem szczepów o właściwościach ściśle określonych potrzebami technologicznymi lub funkcjonalnymi (w tym probiotycznych), ale także wymuszają postęp w zakresie genetyki i fizjologii tych mikroorganizmów.

Przeszukiwanie naturalnych środowisk bytowania bakterii mlekowych pozwala na selekcjonowanie nowych szczepów o interesujących cechach przemysłowych, wielokrotnie korzystniejszych od cech szczepów już stosowanych w przemyśle. Jednak znalezienie szczepu o zestawie wielu cech wymaganych oczekiwaniem producentów żywności, nie zawsze jest prawdopodobne. Rozwój nauki pozwala natomiast na kontrolowane modyfikowanie już istniejących szczepów, w kierunku określonych, wcześniej niewystępujących właściwości lub w celu wzmocnienia takich cech. Metody biologii molekularnej pozwalają na pogłębienie wiedzy na temat bakterii fermentacji mlekowej, izolację i opisanie funkcji konkretnych enzymów bakteryjnych, a także genów je kodujących (a co za tym idzie ułatwiają poznawanie właściwości i aktywności bakterii przemysłowych), poznanie struktury ich genów, organizacji ich genomów oraz funkcjonujących szlaków metabolicznych. A co najważniejsze, dają szansę na genetyczne udoskonalanie mikroorganizmów. Dzięki temu można wprowadzać nowe cechy, które są korzystne dla producentów żywności, ale także eliminować niepożądane właściwości. Rezultatem takich modyfikacji kodu genetycznego jest zmiana w metabolizmie komórki. Wiedza ta umożliwia zintegrowanie ważnych dziedzin nauki, w tym proteomiki (dotyczącej badania białek), genomiki (badanie genomu) oraz metabolomiki (badanie metabolizmu).

Metody klasyczne

© fm

W celu uzyskania doskonalszych szczepów bakterii fermentacji mlekowej, jak dotąd stosowano metody klasyczne (tradycyjne) opierające się na zmianie genotypu na skutek mutacji. Mutację definiuje się jako nagłą, ale trwałą i podlegającą dziedziczeniu, zmianę w zapisie informacji genetycznej komórki, w której wyniku otrzymuje się mutanta (sam proces mutacji jest określany terminem mutageneza). Mutacje mogą przebiegać samorzutnie (spontaniczne), bez konieczności użycia technik inżynierii genetycznej. Do zajścia takiej mutacji potrzebny jest czynnik powodujący w komórce nieprawidłową replikację lub transkrypcję nici DNA. Do takich czynników, praktycznie wykorzystywanych w laboratorium do zwiększania częstotliwości występowania mutacji w komórkach bakteryjnych, zalicza się m.in. czynniki fizyczne: światło UV, promieniowanie jonizujące, gamma, X oraz czynniki chemiczne: kwas azotawy, metanosulfonian etylu, N-metylo-N’-nitro-N-nitrozoguanidynę.

Efektywność mutagenezy zależy od rodzaju i stężenia zastosowanego czynnika, fazy wzrostu komórek mikroorganizmów, warunków prowadzenia ich hodowli oraz stopnia sprawności mechanizmów naprawczych działających w komórce bakteryjnej. Wadą naturalnej mutagenezy są nieprzewidywalne zmiany właściwości (zmiany w genomie komórek bakterii są niekontrolowane, zatem większość mutacji jest obojętna lub może zmniejszać użyteczność otrzymanych mikroorganizmów, a zmiany pojawiające się w efekcie mutacji mogą, ale nie muszą prowadzić do poprawy cech komórki bakteryjnej – szacuje się, że zaledwie mały procent indukowanych mutacji jest technologicznie pożytecznych), a ponadto wyselekcjonowanie szczepów o interesujących właściwościach jest niezwykle trudne, czaso- i kosztochłonne). Zaletami mutagenezy są: łatwość użycia metody, jej dostępność, a co najważniejsze powszechna akceptacja mutagenezy jako techniki naturalnej, dzięki czemu drobnoustroje modyfikowane tą drogą są od lat dopuszczane do użytku przemysłowego, bowiem nie mają statusu mikroorganizmów genetycznie modyfikowanych (tj. GMO).

Metody rekombinacji genetycznej

Innym sposobem modyfikowania mikroorganizmów jest wykorzystanie nowoczesnych technik inżynierii genetycznej. Ogólnie ujmując, technik genetycznych wykorzystywanych do rekombinacji genetycznej komórek drobnoustrojów jest bardzo wiele, ale w przypadku ulepszania oraz tworzenia nowych, pożytecznych szczepów mikroorganizmów o ściśle określonych cechach wykorzystuje się zaledwie kilka z nich. Przykładem są techniki: rekombinacji DNA in vitro oraz rekombinacji DNA in vivo.

Rekombinacja DNA in vivo dotyczy przenoszenia informacji genetycznej między komórkami poszczególnych szczepów, gatunków, a nawet rodzajów bakterii fermentacji mlekowych. Jest to możliwe dzięki mechanizmom naturalnie występującym w przyrodzie: transformacji, koniugacji oraz transdukcji. Wprawdzie możliwość ich zajścia zależy od wielu czynników, w tym przynależności taksonomicznej komórek bakterii i warunków środowiskowych, za to są niezawodne. Te naturalne mechanizmy są wykorzystywane w warunkach laboratoryjnych do genetycznych modyfikacji komórek mikroorganizmów, co pozwala m.in. na wprowadzenie obcego DNA do komórek mikroorganizmów.

© fm

Rekombinacja DNA in vitro polega na przenoszeniu fragmentu materiału genetycznego między komórkami drobnoustrojów za pomocą specjalnie skonstruowanego wektora, a następnie jego powieleniu (klonowaniu). Transfer może dotyczyć zarówno pojedynczego genu lub kilku genów, i jest prowadzony w sposób ściśle kontrolowany. Dzięki takiej modyfikacji, komórka mikroorganizmu nabywa właściwości, której do tej pory (czyli w warunkach naturalnych) nie wykazywała. Dla przykładu, skutkiem przeniesienia genu kodującego jakieś białko z jednej komórki bakteryjnej do innej komórki bakteryjnej może być przeniesienie zdolności do biosyntezy takiego samego białka. Oczywiście, nie jest możliwe nieograniczone przenoszenie dowolnych genów między dowolnymi mikroorganizmami, należy bowiem pamiętać o różnicach występujących między tymi organizmami, szczególnie pod względem rozpoznawania i odczytywania informacji genetycznej (bez tego wprowadzona informacja genetyczna po prostu nie zostanie wykorzystana w życiu komórki bakteryjnej). Aby rekombinacja DNA in vitro zakończyła się sukcesem, należy jak najlepiej dostosować konstruowany fragment informacji genetycznej do genetycznych cech jej biorcy. Ponadto, trzeba pamiętać o stabilności konstruowanego wektora, warunkach prowadzenia hodowli komórek bakteryjnych, stabilności struktury zrekombinowanego DNA, a także poziomie ekspresji przeniesionych genów. Na potrzeby techniki rekombinacji DNA in vitro stosowanej wobec drobnoustrojów wykorzystywanych w produkcji żywności (a nawet stosowanych do modyfikacji surowców żywnościowych) opracowano tzw. wektory klasy „food grade”, czyli uznanych za bezpieczne dla żywności. Do takich wektorów należą bakteriofagi lub plazmidy naturalnie występujące w komórkach mikroorganizmów powszechnie uznanych za bezpieczne (np. Lactobacillus, Lactococcus, Streptococcus oraz Bifidobacterium).

Modyfikacje genetyczne – osiągnięcia

W przemyśle mleczarskim stosowanie wyselekcjonowanych szczepów o pożądanych właściwościach pozwala na przeprowadzenie prawidłowego przebiegu procesu technologicznego lub otrzymanie produktu o określonych cechach jakościowych, m.in. konsystencji, struktury, smaku i zapachu, trwałości i/lub wartości żywieniowej (zmniejszona zawartość składników niekorzystnych dla niektórych konsumentów, np. laktozy czy cholesterolu, lub zwiększony poziom cennych substancji, np. witamin). Wykorzystanie modyfikacji genetycznej pozwala biotechnologom naprawiać lub korygować wady metaboliczne bakterii fermentacji mlekowej, wynikające z niewystarczającej aktywności enzymów bądź ich nadprodukcji.

Naukowcom udało się wykorzystać klasyczną mutagenezę do otrzymania mutantów produkujących zwiększone ilości laktazy, a więc doskonałych do naturalnej i efektywnej redukcji poziomu laktozy w mlecznych napojach fermentowanych. Komórki bakterii fermentacji mlekowej zostały w tym celu poddane działaniu mutagenów, w efekcie osiągnięto wysoką częstość mutacji, w tym zwiększoną aktywność enzymu na podłożu z laktozą w zakresie od 70% do 222%, a to już może okazać się wystarczające do poprawienia zdolności w komórkach bakteryjnych do biosyntezy aktywnego enzymu β-D-galaktozydazy (tj. laktazy) i łagodzenia objawów nietolerancji laktozy u konsumentów cierpiących na niedobory tego enzymu. Możliwe jest również skonstruowanie wektora umożliwiającego wprowadzenie do komórek bakterii fermentacji mlekowej niefermentujących laktozy genu obcego pochodzenia, kodującego ekspresję laktazy. Takie przeniesienie genu techniką rekombinacji DNA in vitro jest możliwe między różnymi gatunkami bakterii fermentacji mlekowej. Możliwe jest również uzyskanie nadekspresji genu lacZ, pochodzącego z E. coli, w komórkach bakterii fermentacji mlekowej.

© fm

Rozkład laktozy podczas fermentacji mleka, z wykorzystaniem bakterii fermentacji mlekowej, powoduje w pierwszej kolejności hydrolizę cząsteczek tego cukru do glukozy oraz galaktozy. O ile glukoza jest bardzo szybko wykorzystywana przez komórki bakteryjne do celów energetycznych, to galaktoza może gromadzić się w fermentowanym mleku, gdyż nie wszystkie bakterie fermentacji mlekowej są zdolne do jej wykorzystania. Okazuje się, że dla pewnego wąskiego grona konsumentów galaktoza skumulowana w żywności może być bardzo niebezpieczna. Chodzi tu o osoby cierpiące na galaktozemię, których organizmy nie wytwarzają enzymu niezbędnego w metabolizmie galaktozy. Gromadzenie nierozłożonej galaktozy w organizmie człowieka może zagrażać zdrowiu, a nawet życiu (upośledzać lub uszkadzać narządy wewnętrzne, takie jak wątroba, nerki, układ nerwowy, a także soczewkę oka). Nieleczona galaktozemia może w ostateczności doprowadzić do śmierci. Biotechnologom udało się spontanicznie uzyskać mutanty bakterii fermentacji mlekowej wykazujące zmiany w sekwencji w operonie gal, co może być wykorzystane do znaczącej redukcji poziomu galaktozy w mlecznych produktach fermentowanych. Ciekawym kierunkiem genetycznego udoskonalania bakterii fermentacji mlekowej jest zintensyfikowanie zdolności do hydrolizy laktozy, ale zablokowanie uwolnionych cukrów prostych (glukozy i galaktozy) do dalszego wykorzystania przez komórki bakteryjne. W rezultacie otrzymuje się mleczne napoje fermentowane naturalnie słodzone, bez konieczności stosowania dodatkowych substancji słodzących.

Fermentacja laktozy przez bakterie fermentacji mlekowej skutkuje wytworzeniem kwasu mlekowego i zwiększeniem kwasowości mleka fermentowanego. Ta aktywność fermentacyjna bakterii może jednak trwać nawet w warunkach chłodniczych, powodując stopniowe przekwaszanie produktów. Wiadomo już że także w tym zakresie, biotechnolodzy znaleźli rozwiązanie, modyfikując komórki bakteryjne i ograniczając ich zdolność fermentacyjną laktozy lub ewentualnie przekierowując ją na sacharozę. W rezultacie, mleczny napój fermentowany może być przechowywany przez odpowiednio długi czas, bez ryzyka przekwaszenia. Z żywieniowego punktu widzenia istotna jest forma optyczna kwasu mlekowego. Niektóre bakterie fermentacji mlekowej wykazują zdolność do syntezy kwasu D(-) mlekowego, który jest bardzo powoli metabolizowany przez organizm człowieka (kumulujący się we krwi kwas D(-) mlekowy może wywoływać kwasicę mleczanową lub problemy jelitowe). Możliwa jest jednak inaktywacja genu kodującego dehydrogenazę D(-) mleczanową i przekierowanie aktywności komórek bakteryjnych w stronę produkcji kwasu L(+) mlekowego.

Podczas fermentacji mleka bakterie fermentacji mlekowej wytwarzają wiele związków chemicznych, nadających finalnym produktom określone cechy smakowo-zapachowe. Również w tym zakresie możliwe jest genetyczne udoskonalanie komórek bakteryjnych i poprawianie cech organoleptycznych produktów fermentowanych. Techniki takie służą do otrzymania szczepów bakterii cechujących się zwiększoną syntezą L-alaniny, 5’-nukleotydów lub białek o słodkim smaku, ewentualnie zablokowaną zdolnością do wytwarzania tzw. gorzkich peptydów.

© fm

Bakterie fermentacji mlekowej można udoskonalić również w kierunku zdolności do metabolizowania innych cukrów, niż laktoza lub galaktoza, nierozkładalnych przez organizm człowieka, a obecnych w żywności. W ostatnim czasie w tym zakresie badań kładzie się nacisk na rozkład cukrów obecnych w surowcach roślinnych wykorzystywanych do produkcji wegańskich alternatyw dla mlecznych napojów fermentowanych. Nasiona roślin strączkowych (np. soja i fasola) są szczególnie bogate w cukry, takie jak rafinoza i stachioza. Kumulowanie tych cukrów w jelitach może wywoływać problemy trawienne u ludzi je spożywających (cukry te nie ulegają trawieniu w dwunastnicy, ale w jelicie grubym mogą ulegać rozkładowi przez bakterie jelitowe z rodzajów Clostridium i Bacteroides, uwalniając jednocześnie duże ilości gazów). Możliwe jest oczywiście wywołanie w komórkach bakterii fermentacji mlekowej nadekspresji genów kodujących enzymy katalizujące rozkład rafinozy i stachiozy. Innym ukierunkowaniem aktywności komórek bakterii fermentacji mlekowej jest nadprodukcja egzopolisacharydów (EPS), czyli wielkocząsteczkowych, liniowych biopolimerów, które mogą działać jako naturalne zagęstniki, stabilizatory, emulgatory, a także substancje nadające strukturę mlecznym napojom fermentowanym.

Genetyczne udoskonalanie bakterii fermentacji mlekowej może służyć również do uzyskiwania produktów o naturalnie zwiększonej zawartości związków korzystnych żywieniowo, np. witamin. Bakterie fermentacji mlekowej mają pewną zdolność do biosyntezy witamin tj. kwas foliowy, ryboflawina (witamina B2), tiamina, kwas pantotenowy, cyjanokobalamina, czy menachinion (witamina K2). Naukowcom udało się zbadać geny odpowiedzialne za biosyntezę wybranych witamin i wykorzystując techniki inżynierii genetycznej doprowadzić do ich nadekspresji, co powoduje nadprodukcję witamin. Co ciekawe, zwiększona synteza jednej z witamin nie działa negatywnie na komórki bakteryjne i nie wpływa na wytwarzanie innych witamin.

Podsumowanie

Rozwój nauki pozwala na bardzo precyzyjne udoskonalanie komórek bakterii fermentacji mlekowej z wykorzystaniem technik inżynierii genetycznej lub metod tradycyjnych mutacji bakteryjnej informacji genetycznej, a jednocześnie umożliwiający zapewnienie bezpieczeństwa i wysokiej jakości, czy wartości żywieniowej żywności fermentowanej. Techniki inżynierii genetycznej pozwalają na zwiększenie potencjału bakterii fermentacji mlekowej, chociaż budzą sprzeciw społeczny. Wiadomo że dotychczas nie wykorzystano przemysłowo wielu interesujących właściwości modyfikowanych genetycznie mikroorganizmów, ze względu na liczne obawy społeczeństwa. Wydaje się zatem konieczne ścisłe kontrolowanie ryzyka zastosowania takich mikroorganizmów, ale jednocześnie intensywna edukacja i dyskusja społeczna.