Dodatki: Egzopolisacharydy bakteryjne

dr inż. Dorota Zaręba, dr hab. Małgorzata Ziarno
Forum Mleczarskie Biznes 4/2017 (30)
dr hab. Małgorzata Ziarno, prof. SGGW, SGGW Warszawa

Egzopolisacharydy (EPS), jak sama nazwa wskazuje, są to molekuły o długich łańcuchach składających się z różnych sacharydów (cukrów), rozgałęzione lub nie, wydzielane przez komórkę na zewnątrz (egzo – oznacza na zewnątrz). Substancje te pełnią w komórce bakteryjnej różne funkcje, przede wszystkim funkcję ochronną, przed: czynnikami środowiskowymi (temperatura, odczyn środowiska, stres oksydacyjny, stres osmotyczny itp.), czynnikami biologicznymi (wirusami bakteryjnymi – bakteriofagami, elementy układu opornościowego gospodarza), a także pełniąc funkcję kolonizacyjną w procesie zasiedlania środowiska w postaci biofilmów, czy też umożliwiając życie w społecznościach mono- lub wielogatunkowych. W technologii żywności zdolność komórek mikrobiologicznych do wytwarzania egzopolisacharydów jest zarówno cechą korzystną, jak i niekorzystną. Obecność egzopolisacharydów jest oczekiwana w znaczeniu strukturotwórczym i zagęszczającym, co może mieć zastosowanie w produkcji mlecznych napojów fermentowanych. Niepożądana obecność egzopolisacharydów są to przede wszystkim przypadki tworzenia się biofilmów, czyli warstw śluzowych, które umożliwiają i ułatwiają kolonizację, rozmnażanie bakterii w instalacjach linii produkcyjnej. Na tej podstawie egzopolisacharydy są dzielone na te, które są uwalniane swobodnie na zewnątrz komórki (śluz o charakterze strukturotwórczym) oraz te, które tworzą otoczkę wokół komórki, związanej chemicznie z warstwą ściany komórkowej i sprzyjającą tworzeniu warstwy śluzu – biofilmu.

Jak już wspomniano, EPS są to biopolimery (biologiczne substancje długołańcuchowe). Te długołańcuchowe polimery zbudowane są z powtarzających się fragmentów (merów), które tworzą długie liniowe łańcuchy. Niektóre biopolimery tworzą łańcuchy boczne, tzw. rozgałęzienia. Pojedyncze jednostki (mery) najczęściej związane są między sobą wiązaniem glikozydowym o strukturze α lub β. Dokładna charakterystyka wiązania uwzględnia także numery atomów węgla biorącego udział w tworzeniu wiązania. Pod względem składu chemicznego, a konkretnie rodzaju monocukrów wchodzących w skład łańcucha, polisacharydy dzieli się na homopolisacharydy i heteropolisacharydy.

Homopolisacharydy są to łańcuchy, w których składzie występuje jeden typ monosacharydu: D-glukopiranozy (np. glukozy) lub D-fruktofuranozy (np. fruktozy). Homopolisacharydy są syntetyzowane przez enzymy zewnątrzkomórkowe wykorzystujące sacharozę lub laktozę jako źródło fruktozy lub glukozy. W przypadku homopolisacharydów wyróżnia się cztery typy polimerów: α-D-glukany, β-D-glukany, fruktany i inne. Najczęściej wykorzystywane w praktyce homopolisacharydy są polimerami składającymi się z reszt będących pochodnymi glukozy (glukany), fruktozy (fruktany) lub innych cukrów prostych. Podstawowym monosacharydem jest glukoza, dlatego łańcuch polimerowy, składający się z podjednostek glukozowych, jest najprostszym przykładem biopolimeru cukrowego. Grupa łańcuchów zbudowanych z D-glukozy jest określana jako D-glukany. W zależności, czy merem jest α-D-glukoza, czy β-D-glukoza, w grupie tej otrzymać można odpowiednio α-D-glukany lub β-D-glukany. Przykładem α-D-glukanów są dekstrany złożone z reszt glukozy połączonych wiązaniami α-1,6-glikozydowymi o różnym stopniu rozgałęzienia. Pierwszym gatunkiem bakterii fermentacji mlekowej wykazującym zdolność do wytwarzania śluzotwórczych EPS jest Leuconostoc mesenteroides. Po szczegółowej ich analizie, potwierdzono produkcję dekstranu przez wybrane szczepy bakterii z tego gatunku. Dekstrany mają bardzo szerokie zastosowanie pozażywnościowe, jak na przykład w produkcji preparatów krwiozastępczych. Innym przykładem α-D-glukanu są alternany, które różnią się od dekstranu rodzajem wiązań pomiędzy resztami D-glukozy. Alternany charakteryzują się naprzemiennym występowaniem wiązań α-1,6-glikozydowym i α-1,3-glikozydowym. Podobnie, jak w pierwszym omawianym przykładzie EPS, producentem alternanu są różne szczepy bakterii z gatunku Leuconostoc mesenteroides. Niepożądanym dla człowieka przykładem α-D-glukanu jest nierozpuszczalny w wodzie biopolimer o nazwie mutan, charakteryzujący się dominującym udziałem wiązania α-1,3-glikozydowego, produkowany przez mikroflorę jamy ustnej (bakterie z gatunków Streptococcus mutant i Streptococcus sobrinus). Spośród β-D-glukanów najbardziej znany jest kurdlan, charakteryzujący się wiązaniem β-1,3-glikozydowym między resztami glukozy. Do mikrobiologicznych producentów kurdlanu zalicza się między innymi szczepy bakterii z gatunku Pediococcus damnosus i rodzaju Lactobacillus, najczęściej wykorzystywane do produkcji opatentowanych preparatów immunologicznych. Należy także zauważyć, że bogatym źródłem β-glukanów są produkty zbożowe w tym szczególnie owies, co oznacza, że tego typu EPS mogą być syntetyzowane również przez rośliny. Do najczęściej izolowanych fruktanów, czyli polimerów będących efektem połączenia różnym rodzajem wiązań D-fruktozy, są lewan i fruktany typu inulina. Lewan jest to polimer charakteryzujący się wiązaniami β-2,6-glikozydowymi, zaś inulina – wiązaniami β-2,1-glikozydowymi. Mikrobiologicznymi producentami wymienionych fruktanów są między innymi szczepy z gatunków, odpowiednio dla lewanu Leuconostoc mesenteroides, dla inuliny Lactobacillus reuterii.

Z kolei łańcuchy heteropolisacharydów są złożone z podjednostek, w których skład wchodzą różne monosacharydy, o strukturze liniowej lub rozgałęzionej. Podjednostki heteropolisacharydów zawierają najczęściej od 3 do 8 reszt. Biosynteza podjednostek, ich polimeryzacja oraz transport na zewnątrz komórki wymagają aktywności szeregu enzymów i białek wewnątrzkomórkowych. Dla przykładu, heteropolisacharydy wytwarzane przez komórki bakterii z gatunku Lactococcus lactis subsp. cremoris składają się w dominującym udziale z trzech monosacharydów: D-glukozy, D-galaktozy i L-ramnozy, to znaczy, że podjednostka (mer) tego polimeru składa się z trzech reszt. Struktura EPS wykazuje specyficzność zależną od szczepu lub gatunku wytwarzających je bakterii. Różnice te przekładają się zarówno na skład monocukrów (merów), jak i wiązań występujących pomiędzy podjednostkami, ale również podstawników niecukrowych występujących w biopolimerze sacharydowym. Różnice występujące w heteropolisacharydach wynikają przede wszystkim ze składu podjednostek pod względem ilości i sekwencji monosacharydów, jak i rodzaju wiązań występujących między nimi. Na różnice te bezpośredni wpływ mają bakteryjni producenci i ich zdolności metaboliczne, które zależą zarówno od gatunku, jak i szczepu. Ogólny skład chemiczny heteropolisacharydów jest zbliżony i w większości przypadków składają się z D-glukozy, D-galaktozy, L-ramnozy, w różnej proporcji. Pierwszym opisanym mikrobiologicznym heteropolisacharydem był wyizolowany ze środowiska bytowania EPS wytwarzany przez jeden ze szczepów z gatunku Streptococcus thermophilus, typowego gatunku jogurtowego. Taki biopolimer zawierał D-glukozę, D-galaktozę i N-acetylo-D-galaktozaminę, w stosunku 2:1:1, inne szczepy z tego gatunku syntetyzują polisacharydy z udziałem ramnozy, N-acetylowanej galaktozo- lub glukozoaminy. Różnice w składzie przekładają się na różnice w lepkości i ogólnej strukturotwórczości polisacharydów. Z kolei dla gatunków bakterii mlekowych z rodzaju Lactobacillus skład i struktura chemiczna EPS są bardzo różnorodne. Na skład wytwarzanych polisacharydów ma także wpływ środowisko pochodzenia określonego gatunku (przemysłowe lub ludzkie). Niektóre szczepy bakterii mlekowych wykazują zdolność do syntezy dwóch typów EPS, dla przykładu wybrane szczepy z gatunku Lactococcus lactis subsp. cremoris wytwarzają polisacharydy o odczynie kwaśnym (mające w składzie galaktozę, glukozę, ramnozę, glukozaminę i fosforan) oraz o charakterze obojętnym (zawierające galaktozę, glukozę i glukozaminę).

Wymienione powyżej egzopolisacharydy należą do grup, które wytwarzane są przez bakterie fermentacji mlekowej. Poza tymi polimerami w powszechnym zastosowaniu są także polisacharydy syntetyzowane przez inne mikroorganizmy niż bakterie fermentacji mlekowej. Do takich biopolimerów zaliczyć należy: celulozę, ksantan, alginian, guma gellan oraz kwas hialuronowy. W technologii żywności z powodzeniem są wykorzystywane przede wszystkim: guma ksantan, guma gellan i alginian. Ksantan od 1969 roku jest zarejestrowany jako bezpieczny dodatek do żywności pod symbolem E 415. Strukturalnie jest to heteropolisacharyd o łańcuchu rozgałęzionym składającym się z reszt D-glukopiranozy połączonych wiązaniami β-1,4-glikozydowymi, przy czym co druga reszta jest podstawiona resztą złożoną z dwóch jednostek D-mannopiranozy i jednostki kwasu D-glukuronowego, zaś końcowa reszta mannozy podstawiona jest resztą dwóch jednostek kwasu pirogronowego. Dzięki tak specyficznej budowie, ksantan tworzy pseudoplastyczne roztwory już w bardzo niskich stężeniach (0,05-1%). Stopień upochodnienia oraz masa cząsteczkowa molekuły przekłada się na jej właściwości strukturotwórcze. Dodatkowo, obecność gluko- i galaktomannanów pochodzenia roślinnego wpływa na proces żelowania w efekcie synergistycznego oddziaływania z ksantanem. Najczęściej wykorzystywanym producentem biotechnologicznym ksantanu są różne szczepy bakterii z gatunku Xantomonas campestris. Do mikrobiologicznych producentów egzopolisacharydów należą również bakterie Gram-ujemne, jak na przykład z gatunku Acetobacter xylinum, zaś od 1998 roku Gluconacetobacter xylinum, który w procesie biosyntezy wytwarza celulozę w postaci pulpy, rurek, kulek lub płata o strukturze przypominającej skórkę, stąd też często nazywa się ją „sztuczną skórą”. Mikrobiologiczna celuloza cechuje się dużą czystością i sto razy cieńszymi włóknami w porównaniu do celulozy roślinnej, co przekłada się na proces produkcji, ochronę środowiska i cechy technologiczne produktu finalnego. Celuloza mikrobiologiczna jest wykorzystywana głównie w medycynie, ale także jako cenne źródło błonnika spożywczego. W najbliższej przyszłości nie jest wykluczone zastosowanie egzopolisacharydów tego typu, dotychczas niekojarzonych z żywnością, jak na przykład kwas hialuronowy. Jest to liniowy wysokocząsteczkowy polisacharyd w strukturze chemicznej składający się z reszt 2-acetamido-2-deoksy-D-glukopiranozy i kwasu D-glukopiranouronowego, które są połączone odpowiednio wiązaniami: β-1,4-glikozydowymi i β-1,3-glikozydowymi. Kwas hialuronowy wykazuje silne właściwości higroskopijne. Przyjmuje się, że 1 g tego kwasu może wiązać nawet do 6 litrów wody. Z powodzeniem jest już wykorzystywany w kosmetyce, urologii, medycynie estetycznej i, co należy podkreślić, stanowi część struktur międzykomórkowych ciała ludzkiego. Mikrobiologiczne źródło tej substancji jest podstawowym i konkurencyjnym źródłem pozyskania. Między innymi producentami kwasu hialuronowego są niektóre szczepy bakterii mlekowych z gatunku Streptococcus thermophilus.

Wykorzystanie mikrobiologicznych egzopolisacharydów w produkcji żywności może i odbywa się na dwa sposoby. Pierwszą i od dawna praktykowaną, początkowo nieświadomie stosowaną, metodą była fermentacja, przede wszystkich znajdująca zastosowanie w produkcji mlecznych napojów fermentowanych. W czasie procesu fermentacji niektóre szczepy bakterii fermentacji mlekowej wykorzystując dostępny substrat (laktozę i uwolnioną z niej glukozę) tworzą egzopolisacharydy nadające końcowemu produktowi aksamitną i zwięzłą strukturę. W efekcie badań biotechnologicznych ukierunkowanych na dobór odpowiednich szczepów wchodzących w skład kultury jogurtowej, opracowano takie kultury starterowe, które charakteryzują się wysoką aktywnością zagęszczającą.

Drugim sposobem wykorzystania mikrobiologicznych EPS jest użycie czystej formy (preparatów) egzopolisacharydów o właściwościach strukturotwórczych (np. ksantanu, gellanu, alginianu, inuliny, celulozy, itp). Obecnie, najczęściej wykorzystywane są: guma ksantan, guma gellan i alginian. W aspekcie technologicznym egzopolisacharydy mają właściwości hydrofilowe, strukturotwórcze i zagęszczające; w przemyśle spożywczym najczęściej określane mianem hydrokoloidów. Cechą hydrokoloidów jest rozpuszczanie się lub pęcznienie w ciepłej lub zimnej wodzie, w efekcie wiązania wody. Zależnie od rodzaju, hydrokoloidy powodują zwiększenie lepkości lub tworzenie zolu, a nawet przestrzennej struktury żelowej. Zależnie od rodzaju, potrafią tworzyć roztwory od wysokiej do niskiej lepkości, i te są najczęściej stosowane jako substancje zagęszczające lub stabilizujące produkt spożywczy. Intensywność stopnia lepkości roztworów hydrokoloidowych zależy od masy cząsteczkowej – im większa masa cząsteczkowa EPS, tym wyższa lepkość roztworu. Podobny wpływ ma kształt cząsteczek. Te egzopolisacharydy, które cechują się większą liczbą rozgałęzień i elastycznością w strukturze łańcucha, tworzą mniej lepkie roztwory. I przeciwnie, te EPS o liniowej strukturze i sztywnym łańcuchu, tworzą roztwory o większej lepkości roztworu. Ponadto, uwzględniając synergistyczne współdziałanie hydrokoloidów, należy umiejętnie dopracować takie połączenia, które zmaksymalizują efekt technologiczny i pozwolą zminimalizować udział poszczególnych dodatków w produkcie. Przykładem synergistycznego współdziałania hydrokoloidów jest połączenie polimerów żelujących z nieżelującymi, co pozwala zminimalizować synerezę występującą na etapie przechowania produktów o strukturze żelowej. Należy pamiętać, że niektóre hydrokoloidy, jak na przykład guma gellan i alginian, tworzą żele. Jednak do ich aktywności potrzebne są kationy wapnia, magnezu, potasu lub sodu. Dla przykładu, guma gellan, przy wyższych stężeniach soli (> 100 mM) tworzy termonieodwracalne żele, natomiast przy niskich stężeniach soli – żele termoodwracalne.

Unijny wykaz dodatków do żywności, opublikowany jako Rozporządzenie Komisji (UE) nr 1129 z 11 listopada 2011 r., zmieniający załącznik II do Rozporządzenia Parlamentu Europejskiego i Rady (WE) nr 1333/2008 poprzez ustanowienie unijnego wykazu dodatków do żywności, uwzględnia wszystkie wymienione w niniejszej publikacji egzopolisacharydy jako dodatki z grupy pierwszej, których zalecane dozowanie powinno być realizowane według zasady quantum satis. Wyjątkiem jest polimer kwasu hialuronowego, który ze względu na fakt, że kwas ten jest naturalnym składnikiem zwierzęcego organizmu, podobnie jak kolagen, nie jest zaliczany do grupy dodatków do żywności.

Wielokierunkowe wykorzystanie egzopolisacharydów mikrobiologicznych pozwala na zastosowanie tych substancji w przemyśle spożywczym na szeroką skalę. Głównym powodem wykorzystania w produkcji żywności jest poprawa tekstury, struktury i w efekcie końcowym podwyższenie oceny jakości przez potencjalnego konsumenta. Istotne jest również wkład strukturotwórczy egzopolisacharydów w tworzeniu i produkcji nowych rodzajów żywności. W aspekcie utrwalającej się tendencji „czystej etykiety” skutecznym rozwiązaniem jest użycie w produkcji wyrobów fermentowanych zarówno kultur bakterii fermentacji mlekowej o dobrej aktywności zagęszczającej, jak i preparatów ich metabolitów. Zastosowanie mikroflory zdolnej do syntezy egzopolisacharydy wpływa na stabilność fizyczną białej masy mlecznej poprzez zwiększenie jej plastyczności i jędrności. Dodatkowym czynnikiem promującym szczepy bakterii mlekowych, zdolnych do produkcji egzopolisacharydów, jest ich zdolność do wiązania metali ciężkich (a tym samym detoksykacji surowca lub produktu) i ograniczeniu ich wchłaniania do układu krwionośnego.